BRCA1在同源重组修复中的作用

赵音珺， 杨小杭

(浙江大学 医学院， 杭州310000)

乳腺癌是目前全球发病率最高的癌症之一，且发病率逐年增高。众多研究指出BRCA1基因的突变与卵巢癌和乳腺癌的发生密切相关。1990年Hall等学者通过对大量具有早发性乳腺癌病例的家庭进行连锁分析，首次定位了第一个候选的乳腺癌相关基因，并将其命名为乳腺癌相关基因1(Breast cancer 1, early onset)[1,3]。1994年BRCA1基因首次被克隆，与此同时BRCA1编码序列的突变在患有多例乳腺癌的家庭中被鉴定出来[2-3]。

乳腺癌和卵巢癌易感性基因检测已经整合到临床肿瘤治疗中，用于检测BRCA1突变的技术有蛋白质截断检测、DNA芯片技术、直接测序技术和MLPA等[4]。而BRCA1蛋白功能的研究主要在小鼠模型中进行，众多研究表明，BRCA1参与多项细胞活动。其中Brca1突变小鼠胚胎发育的研究揭示了BRCA1在HR修复途径中的主要功能。通过总结相关小鼠胚胎发育的研究成果介绍HR修复途径中的重要蛋白BRCA1的研究进展。在未来的研究中，BRCA1相关的乳腺癌和卵巢癌的特定分子遗传学分析及对BRCA1的相关功能了解可能会促进新的靶向疗法的发展。

1 BRCA1基因

1.1 人源BRCA1基因

人源BRCA1基因是一个肿瘤抑制基因，BRCA1基因位于17号染色体长臂端12-21区域(17q12-21)，约81 kb[3]。BRCA1编码的mRNA长约7.8 kb，共有24个外显子,其中共有22个外显子能够编码氨基酸序列。第11号外显子最长，约3.4 kb，编码BRCA1中超过60%的氨基酸序列。而第1号和第4号外显子不具备功能性[5]。多年来对BRCA1基因的研究增强了人类对相关遗传性和散发性癌症的认识，也使得对应的治疗方案及预防措施有重大突破。

1.2 BRCA1蛋白的结构与功能

以人源BRCA1蛋白为例，BRCA1在包括乳腺和卵巢在内的许多组织中高度表达，由1 863个氨基酸残基组成，约220 ku。BRCA1蛋白的主要结构[2]：(1)RING结构域。其N端有一环状锌指结构域，具有Cys3-His-Cys4结构，能与BARD1(BRCA1-associated RING domain)蛋白相互作用，形成异源二聚体，该异源二聚体具有E3泛素连接酶的功能[6]。(2)NLS核定位信号。BRCA1蛋白分别在氨基酸503KRKRRP508和606PKKNRLRRK615处包含两个核定位信号，两者皆由11号外显子编码，且都可以引导BRCA1进入细胞核[7]。(3)CC结构域。螺旋结构域(coiled-coil domain)由1 364～1 437位氨基酸残基组成。BRCA1的CC结构域能识别PALB2的螺旋结构域，与PALB2蛋白结合，进一步形成BRCA1-PALB2-BRCA2复合体，这一复合体能够促进重组酶RAD51募集到单链DNA处[8-9]。(4)BRCT结构域。BRCA1蛋白羧基端(BRCA1 C-terminal)区域有两个相邻的BRCT结构域，单个BRCT结构域含有约110个氨基酸残基。BRCT结构域具有转录激活的功能，该结构域也能与许多蛋白质结合，包括Abraxas、BRIP1(也称为FANCJ)和CtIP等，这些蛋白与BRCA1相互作用共同参与DNA损伤修复[10]。

图1 BRCA1蛋白结构示意图(改自文献[11])Figure 1 Schematic diagram of BRCA1 protein structure(adapted from reference[11])

1.3 BRCA1同源蛋白

多种哺乳动物中存在BRCA1同源蛋白，且蛋白序列高度保守。不同物种的BRCA1同源蛋白长度相近，都含有主要结构域：RING结构域、BRCT结构域、与PALB相互作用的区域等。BRCA1同源蛋白参与多项细胞活动，本文主要论述其在HR途径中的作用。BRCA1能够募集至DSB位点，参与调控HR损伤修复。其RING结构域与BARD1形成的异源二聚体能够在HR修复DSB的过程中促进DNA末端切割；BRCA1同源蛋白还能与PALB相互作用促进重组酶RAD51的募集[12-13]。表1列举了几种具有代表性的哺乳动物的BRCA1同源蛋白，并进行比较(数据来源：https://www.uniprot.org)。

2 BRCA1蛋白在HR修复中的作用

2.1 DSB损伤修复

BRCA1蛋白参与DNA损伤修复，在HR中发挥重要作用[14]。生物体内多种因子会对DNA造成损伤，其中DNA双链断裂(double-strand breaks， DSB)是对细胞而言危害性最大的DNA损伤形式。随着时间的推移，未修复的DSB在生物体内发生累积，将会导致细胞衰老或细胞凋亡的发生，而DSB的错误加工则会损坏基因组的稳定性并诱导癌症的发生[15]。DSB形成原因众多，外源性因素包括电离辐射、紫外线、拓扑异构酶抑制剂和化学物质等，内源性因素包括复制压力、V(D)J重排和程序性因素等[16-17]。DSB主要通过非同源末端连接(nonhomologous end-joining，NHEJ)和HR两种途径来修复[18-20]。NHEJ是一种不需要同源模板，直接将DNA末端连接在一起的快速修复方式，NHEJ途径错配率较高，易造成DNA损伤位点碱基序列的改变，从而导致遗传信息的丢失。而HR途径则需要同源序列作为修复模板，使得DNA断裂处丢失的遗传信息得以恢复，是一种较为慢速但非常精确的DSB修复方式[21-22]。

图2 DSB损伤修复途径的选择Figure 2 The choice of DSB damage repair pathway

2.2 HR修复途径

HR是一种在机制上非常保守且高保真的修复途径，因此可以维持基因组完整性。在HR修复途径中，BRCA1蛋白在多个步骤中发挥作用[23]。细胞中的DSB位点首先被MRN(MRE11-RAD50-NBS1)复合物识别，MRN复合物被募集到DNA末端，进一步激活ATM(ataxia-telangiectasia mutated)蛋白激酶，ATM激酶通过与NBS1的C末端结合而被募集到DSB位点。活化的ATM激酶能使DNA损伤修复所涉及的多种蛋白质发生磷酸化，随之放大损伤信号[24-25]。ATM可以在多个位点磷酸化BRCA1，被激活的BRCA1被募集至DSB位点，形成的BRCA1-BARD1复合物与53BP1发生拮抗，使DSB通过HR方式得以修复[26]。HR修复起始于DNA末端切除——5′DNA链从断裂位点沿5′到3′方向发生降解，产生3′ssDNA单链[27]。DNA末端切除包含2个步骤：(1)由细胞中的MRN(MRE11-RAD50-NBS1)复合物和磷酸化的CtIP共同作用在5′端完成短程DNA末端切割，产生较短的3′ssDNA，BRCA1能够有效促进该步骤的进行[28]。远程切除因子包括两种核酸酶：dsDNA特异性核酸外切酶EXO1和ssDNA特异性的5′→3′核酸酶DNA2，EXO1可特异性降解dsDNA中5′末端的DNA链，与核酸酶DNA2共同作用，最终产生长度可达几千个碱基的3′ssDNA突出端[27]。DNA末端切除产生的长距离ssDNA，迅速被复制蛋白A(replication protein A，RPA)包被，RPA是一种ssDNA结合蛋白，可以抑制3′ssDNA末端被降解，并且防止ssDNA自身退火形成二级结构[29]。(2)3′ssDNA上的RPA会被重组酶RAD51取代，相较于RPA重组酶RAD51与DNA链的亲和力更低，BRCA1会在重组酶RAD51取代RPA的过程中发挥作用。BRCA1可以与PALB2和BRCA2结合，从而介导与BRCA2结合的重组酶RAD51装配至ssDNA，随后重组酶RAD51将会取代ssDNA上的RPA产生RAD51-ssDNA结构[30]。重组酶RAD51能够促进ssDNA向同源双链DNA模板入侵，形成D-loop结构，重组酶RAD51在RAD54的帮助下发生解离[31-32]。

HR有两种主要亚通路，一是双链断裂修复(double strand breaks repair，DSBR)：D-loop形成后，入侵链根据模板链完成复制后又会进行第二次末端的捕获，产生dHJ(double holiday junction)结构。dHJ结构在特异性核酸内切酶作用下会产生交叉产物(crossover，CO)或非交叉产物(noncrossover，NCO)。此外dHJ结构也可以在特异性解旋酶BLM和拓扑异构酶TopoIIIα介导下发生溶解(dissolution)，最终解旋产生非交叉产物[34]。在另外一种亚通路SDSA中，D-loop结构中的入侵链完成修复后，在解旋酶RTEL1的作用下发生解离。随后，该链重新退火至原始亲本链DSB另一侧的末端，从而形成互补链介导DSB修复。该途径会发生基因转换，最终产生非交叉产物[34]。

2.3 BRCA1蛋白在HR修复中的功能

DSB产生后BRCA1可以通过C端的BRCT结构域与DNA链相互作用募集至DSB位点。在DSB位点处，BRCA1可以与MRN复合体及效应蛋白CtIP相互作用，促进CtIP的活性，促进由MRN复合体/CtIP负责的DNA末端切除过程[35]。与此同时，BRCA1还可以与在DSB末端处的53BP1发生拮抗，将DNA保护蛋白移除，从而介导DSB损伤修复向HR方向进行。研究表明在BRCA1缺失的情况下，53BP1可以在DSB损伤末端大量募集，从而阻止DNA末端被切除[36-37]。

DNA末端被切除产生单链DNA后，BRCA1能直接与PALB2相互作用产生BRCA1-PALB2-BRCA2复合体，该复合体可以介导重组酶RAD51募集至DSB位点，促进重组酶RAD51替换RPA，形成RAD51-ssDNA结构，有利于下一步DNA单链入侵。研究指出BRCA1和BARD1都能募集至DNA链并且与RAD51相互作用。BARD1与BRCA1相互作用形成的异源二聚体能够有效促进重组酶RAD51的募集，并介导RAD51-DNA链进行同源DNA配对，并且还能增强RAD51的重组酶活性[38-39]。

3 Brca1 基因突变小鼠

3.1 Brca1基因突变小鼠的胚胎发育缺陷

为进一步了解BRCA1的功能，研究者通过基因敲入和敲除技术构建许多Brca1突变基因小鼠模型。这些Brca1基因突变小鼠的生理特征研究能够帮助理解BRCA1在HR修复途径中的作用。到目前为止，已经通过使用不同的基因操作技术在小鼠体内构建了超过20种Brca1突变基因(包括无效突变、条件突变和点突变等)[40]。众多Brca1基因突变小鼠在胚胎期死亡，这表明BRCA1对胚胎发育而言具有重要意义。Brca1基因突变位点不同，则小鼠胚胎死亡时间不同。这表明Brca1不同基因位点对BRCA1蛋白功能具有不同的影响，由于突变基因表达的BRCA1蛋白大小各异，存在的功能域不同且其转录后修饰和翻译后修饰也不同，因此这些Brca1突变基因表达的蛋白存在许多不同情况。在有些突变体中Brca1基因完全失效，无法表达BRCA1蛋白；而有些突变体中的BRCA1蛋白仍存在部分结构域。这些研究提示BRCA1在HR修复途径中还具有其他功能。

3.2 Brca1基因突变胚胎致死的小鼠

研究指出HR途径相关蛋白缺失的小鼠会出现胚胎致死的情况，由此可知HR修复途径在小鼠早期胚胎发育和细胞增殖过程中发挥至关重要的作用[41]。Brca1Δ5-6是一种Brca1的无效等位基因。在这种等位基因中，Brca1第5和第6外显子的序列被替换，突变使得编码RING结构域的序列被破坏，并产生了终止密码子，因此该种Brca1突变基因无法表达BRCA1蛋白。Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠胚胎细胞中也被证实不存在BRCA1蛋白。Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠在胚胎发育至7.5 dpc之前死亡，突变小鼠的胚胎发育不良，其中胚层没有形成的迹象[42]。Brca1Δ5-13是另一种Brca1的无效等位基因。将Brca1flox5-13/flox5-13小鼠与带Cre酶小鼠交配可以获得Brca1Δ5-13/Δ5-13突变小鼠。在这种Brca1突变基因中，第5至13外显子的序列被删除，所有BRCA1的功能域都遭到破坏，Brca1Δ5-13/Δ5-13小鼠也在胚胎期死亡[10,43]。Brca1ex2基因中原有的第2号外显子被替换。第2号外显子编码N端RING结构域，也包含启动子，因此该片段突变将会导致Brca1失效。Brca1ex2/ex2小鼠死于胚胎期6.5～9.5 dpc，迟于Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠胚胎死亡日期。然而Brca1还存在另外一个启动子，当其被激活后能够表达出不包含RING结构的BRCA1蛋白，因此该基因型小鼠胚胎死亡的日期略有推迟[44]。Brca11700T基因通过将neogene插入第20号外显子获得，在Brca11700T/1700T小鼠细胞中，所表达的BRCA1蛋白不存在C端BRCT结构域。BRCT结构域具有使BRCA1与DSB末端结合的功能，由于影响了HR途径，Brca11700T/1700T小鼠胚胎死于9.5～10.5 dpc[45]。

3.3 Brca1基因突变小鼠胚胎致死的挽救

众多Brca1基因突变小鼠的研究结果表明，在早期胚胎发育过程中BRCA1有非常重要的作用。在后续的研究中发现p53信号失活，或者53bp 1的缺失可以在不同程度上挽救Brca1基因突变小鼠胚胎致死的情况。这些结果为BRCA1在胚胎早期发育中的机制研究提供了证据。

3.3.1 p53信号失活的拯救

为研究Brca1Δ5-6/Δ5-6基因型小鼠胚胎致死是否由p53的信号激活导致，研究者构建了Brca1Δ5-6/Δ5-6;p53-/-小鼠模型。研究结果显示，由于部分挽救了发育延迟和细胞增殖的缺陷，Brca1-p53DKO小鼠胚胎的寿命较Brca1Δ5-6/Δ5-6基因型小鼠可以延长1～2 d[46]。此外p53基因缺失、Chk2基因缺失、Atm基因缺失都可以挽救Brca1Δ11/Δ11早期胚胎致死的情况[47-48]。DSB在细胞内大量产生后，p53被ATM激酶磷酸化激活，CHK2也会被ATM激酶激活，在ATM-CHK2通路的介导下，细胞进入细胞检查点，细胞活动阻滞在特定时期。细胞内积聚大量未修复的DSB，细胞会启动凋亡程序，最终导致早期胚胎死亡[49]。如果在Brca1基因缺陷的小鼠中引入p53的缺失，ATM-Chk2-p53信号就无法被激活，因此胚胎发育阻滞可以在不同程度上有所挽救。由此可知，相关Brca1基因缺陷的小鼠胚胎致死是由p53信号激活导致的。

3.3.2 53BP1缺失的拯救

p53结合蛋白1(p53 binding protein 1，53BP1)是p53基因的转录激活物，53bp1缺失也可以挽救Brca1Δ11/Δ11小鼠早期胚胎死亡的情况[50]。然而与p53基因缺失模型不同的是，在Brca1Δ11/Δ11、Trp53bp1-/-小鼠的细胞中，ATM-Chk2-p53信号是完整的。实验证明53BP1缺失通过恢复HR修复途径来挽救Brca1Δ11/Δ11小鼠早期胚胎死亡的情况。53BP1 KO也是通过恢复HR修复途径来挽救Brca1ex2/ex2小鼠早期胚胎死亡的情况[50]。这些实验证明BRCA1能够调控DSB修复途径的选择，使DSB选择通过HR修复途径进行修复[51]。BRCA1还可以与在DSB末端处的53BP1发生拮抗，将DNA保护蛋白移除，介导DSB通过HR途径进行修复。在Brca1基因突变小鼠中，53BP1固定在DSB末端，DNA末端切除无法进行[52]。如果引入53BP1 KO，突变体细胞内DNA末端切除便能发生，HR修复途径在没有完整BRCA1蛋白的情况下被恢复，相关Brca1基因突变小鼠因此被拯救。53BP1的缺失还可以挽救Brca1ΔC/ΔC、Brca1Δ5-13/Δ5-13早期胚胎致死的情况，但与上述挽救方式有所不同。在Brca1ΔC/ΔC基因突变小鼠细胞中，由于HR修复途径中的重要蛋白如RAD51、PALB2等无法募集到DNA切除末端，因此53BP1缺失无法修复由BRCA1介导的HR修复途径。与此同时，研究表明53BP1缺失也不是通过恢复HR修复途径来挽救Brca1Δ5-13/Δ5-13小鼠。但是在Brca1ΔC/ΔC、Trp53bp1-/-和Brca1Δ5-13/Δ5-13、Trp53bp1-/-基因型小鼠中，还存在小部分非BRCA1介导的HR修复途径[53-54]。其中在Brca1Δ5-13/Δ5-13、Trp53bp1-/-小鼠的细胞中，53BP1缺失还使得DSB通过NHEJ的方式得以修复，从而挽救该种Brca1基因缺陷小鼠胚胎致死的情况[53]。

4 总结

BRCA1蛋白参与DNA损伤修复，在HR修复途径中发挥重要作用。在HR修复途径中BRCA1具有两个主要功能：一是促进DNA末端切除，二是介导重组酶RAD51在DSB位点处的装载。为了进一步研究BRCA1的功能，研究者构建了诸多Brca1基因突变小鼠模型。在Brca1基因突变小鼠模型中，通常存在早期胚胎致死的现象。相关研究可以验证BRCA1在HR修复途径中有重要意义的结论。此外一些相关基因的敲除可以在不同程度上挽救Brca1基因突变小鼠胚胎致死的情况。这表明BRCA1还具有另外一项功能：与53BP1发生拮抗，调控DSB修复途径的选择。这些成果提示在以后的研究中，可以通过构建不同的Brca1基因突变小鼠模型，探索BRCA1在HR修复途径中还未解决的问题。