不同授粉量对天麻果实发育及结实的影响

高 尚， 曹小勇， 胡选萍， 蒋景龙， 秦公伟， 赵 垚

(陕西理工大学生物科学与工程学院陕西省资源生物重点实验室, 汉中723000)

天麻(GastrodiaelataBI.)又名定风草、离合草、仙人脚、鬼督邮、赤箭等，属兰科(Orchidaceae)、树兰亚科(Epidendroidae)、天麻族(Gastrodieae)、天麻亚族(Gastrodinae)，是与真菌共生的多年生异养草本植物[1-2]。具镇静安神、抗抑郁、抗焦虑、抗氧化、防病毒和抗肿瘤等多种药理学活性[3]。天麻不能自花授粉，而人工授粉可大幅度提高其产种量[4]。天麻种子细小如尘，自然条件下难以萌发，利用萌发菌在人工培养条件下进行共生萌发是解决这一问题的有效途径[5]。关于兰科植物果实及种子形态研究方面，杨文权[6]研究传统授粉方式(不取唇瓣)和改进授粉方式(用授粉针挑掉唇瓣甚至花被筒的前面部分，然后进行授粉)对天麻果实的影响，统计了天麻果实、种子及种胚的大小；周元等[7]对不同授粉方式下的天麻果实、果实中种子和种胚的大小进行统计；Kiyohara等[8]测量了68种日本兰科植物的种子和胚的大小。

关于不同授粉量对植物果实发育及结实影响研究较少，徐义流等[9]研究了不同品种花粉和授粉量对砀山酥梨果实萼片的影响。在兰科植物方面Proctor等[10]用不同的授粉量对3种兰科植物进行人工授粉研究；Nazarov等[11]表明兰科植物花粉聚合成花粉块，以“全或无”的方式进行授粉，花粉/胚珠的值不同种类变化不大，而每个柱头上花粉的量不同种类变化大。Vale等[12]检测了3种古巴布鲁通兰属(Broughtonialindenii)植物花粉块的数量和类型对果实和种子产量的影响，试验包括：1枚小花粉团/1朵花，4枚小花粉团/1朵花，1枚大花粉团/1朵花，4枚大花粉团/1朵花。结果显示：4种处理的花都能结果，果实大小和发育良好种子的比例显然受到花粉的数量影响，而不是花粉块的类型。1枚花粉块处理的花朵，其果实长度较小并且发育良好的种子数量较少。但目前还未发现利用人工对兰科植物切分的花粉块进行授粉的研究，因此本文利用天麻作为试验材料，以完整花粉块为对照，在解剖镜下将花粉块切分成1/2、1/4、1/8、1/16，研究不同授粉量对天麻果实发育及结实影响，通过测量、数据处理、结果分析，说明不同授粉量对果实、种子发育影响，并且为其他兰科植物的研究提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

所用天麻花序为采自陕西省汉中市留坝县的天麻块茎在实验室中培育而成，果实和种子选自2019年培育成品。

1.2 仪器

解剖针、镊子、解剖镜、天平、尺子、体视显微镜(Leica M205C)、电子天平(梅特勒 AI204)

1.3 方法

人工授粉：花药内的花粉块含2个花粉团，组成花粉块的花粉粒呈微黄色，近球形，花粉粒之间都黏在一起，用解剖针在Nikon SMZ800解剖镜下将完整花粉块切分为原来的1/2、1/4、1/8、1/16(图1)，以完整花粉块授粉作为对照，并将切分好的花粉块分别放在不同天麻花的柱头上，每个处理重复20个。

(a)完整花粉;(b)花粉块由大到小分别为1/2、1/4、1/8、1/16。图1 完整花粉块及切分后不同大小的花粉块Figure 1 The whole pollinarium and different sizes of dividedpollinarium

指标测量：用体视显微镜(Leica M205C)对浸湿的种子进行拍照，Digimize软件测量果实、种子和种胚的形态大小(长度、宽度)。用十万分之一的电子天平(梅特勒 AI204)测量果实干、鲜重和单颗果实种子总干重(种子干重)。

1.4 数据分析

试验数据使用GraphPad Prism 5、spss10.0进行数据分析。统计软件进行数据统计与分析，使用tukey检验进行组间差异显著性检验(P<0.05)并作图。

2 结果与分析

2.1 不同授粉量对果实形态大小和重量的影响

不同授粉量影响果实大小、重量。完整花粉块(对照)授粉的天麻果实长度、宽度分别为1.56 cm、0.72 cm，鲜重、干重分别为0.23 g、0.03 g(图2)，1/2授粉量的与对照无显著差异，1/4授粉量及以下时，果实的形态大小和重量均明显下降。1/4、1/8、1/16授粉量的果实长度、宽度、鲜重之间无差异[图2(a)(b)(d)]，授粉量1/8和1/16的果实干重无差异，见图2(c)。1/4、1/8、1/16授粉量的果实长度分别为1.41 cm、1.34 cm、1.31 cm；果实宽度分别为0.61 cm、0.61 cm、0.57 cm；果实鲜重分别为0.16 g、0.14 g、0.13 g；果实干重分别为0.03 g、0.02 g、0.02 g。

(a)果实长度；(b)果实宽度；(c)果实干重；(d)果实鲜重。不同小写字母表示不同授粉量下的各组数据差异显著(P<0.05)。图2 不同授粉量对果实的影响Figure 2 The effects of different pollen load on fruits

2.2 不同授粉量对种子及种胚形态大小、果实中种子总重量的影响

不同授粉量对种子长度和种胚的大小没有影响，与对照相比，种子宽度略有增加。完整花粉块(对照)授粉的天麻种子长度、宽度分别约为0.56 mm、0.13 mm，种胚长度、宽度分别约为0.16 mm、0.10 mm(图3)，不同授粉量(1/2、1/4、1/8、1/16)的种子长度、种胚长度和宽度与对照无差异，见图3(a)(c)和(d)；不同授粉量(1/4、1/8、1/16)的种子宽度与对照组具有差异，并且授粉量越低，种子宽度越大，见图3(b)。

(a)种子长度；(b)种子宽度；(c)种胚长度；(d)种胚宽度；(e)种子干重。不同小写字母表示不同授粉量下的各组数据差异显著(P<0.05)。图3 不同授粉量对种子及种胚大小影响Figure 3 The effect different pollen load on seed and embryo size

不同授粉量对单颗果实中的种子总干重具有影响，且授粉量越低，总干重越小。授粉量1/2与授粉量1的种子干重都约为0.006 g，授粉量1/4和授粉量1/8的种子干重约为0.003 g和0.0016 g。说明在授粉量为1/2、1/4和1/8时，花粉量与果实中净种子干重成正比，见图3(e)。

2.3 不同授粉量的天麻果实大小与果实内种子总干重的关系

天麻果实大小与果实内种子总干重的相关性分析结果如表1所示，果实长度、果实宽度与果实内种子总干重的相关性呈强相关性(相关系数分别为0.975和0.977)，说明果实越大，果实内种子总干重越高。以上可以得出：天麻果实大小可以作为评价果实内部种子量的依据。

表1 天麻果实大小与果实内种子总干重的相关性分析Table 1 The correlation of fruit size and total dry weightof seeds in fruit of Gastrodia elata

3 讨论与结论

在兰科植物花药形态方面，孙崇波等[13]利用扫描电镜对兰科常见栽培植物5属10种21个品种(系)的花粉块形态进行了观察，表明花粉块表面形态在属间差异较大，在兰属的种间也有一定的差异，但在兰属种内品种间则差异较小；李璐等[14]研究了巾唇兰(Pennilabiumyunnanense)的花粉团发育，表明巾唇兰花粉块由2个球形花粉团、粘盘和粘盘柄组成，与天麻相似；天麻花药内的花粉块含2个花粉团，组成花粉块的花粉粒呈微黄色，近球形。

在不同授粉量对果实和种子影响研究方面，国内外研究较少，在非兰科植物中，徐义流等[9]研究了不同品种花粉和授粉量授粉对砀山酥梨果实萼片的影响，研究表明：适当降低花粉浓度有利于提高果实脱萼率；在兰科植物方面，Proctor等[10]用不同的授粉量对3种兰科植物(Cypripediumcalceolus,Amerorchisrotundifolia,Calypsobulbosa)进行人工授粉，对蒴果称重，并通过液体悬浮进行二次采样来估计种子数，表明授粉量影响C.bulbosa的种子数量，但对C.calceolus或A.rotundifolia没有显着影响，说明天麻与C.bulbosa相似；Vale等[12]研究了3种古巴布鲁通兰属(Broughtonialindenii)植物，检测了花粉块的数量和类型对果实和种子产量的影响，结果表明果实大小和发育良好种子的比例显著受到花粉块的数量影响，而不是花粉块的类型。本研究是人为将天麻花粉块进行切分，完整花粉块和不同大小花粉块对天麻进行授粉之后，子房发育为果实，而后结实，通过测量和数据整理分析发现授粉量降低影响果实大小和重量，但对种子和种胚的形态影响不大。授粉量为1/2与授粉量为1的果实大小、重量无差异，而花粉量为1/4及以下时，与对照的差异显著，说明花粉越少，果实越小，可能是由于化学刺激或物理刺激(发育胚珠较少)下降所导致，研究发现，少量的NAA也可刺激天麻果实发育并且果实内部有少量的无胚种子，可能是由于化学刺激减少所导致的。

花粉数量与胚珠数量的比值(P/O)是生殖系统的一个重要定量特征。 Cruden认为：P/O反映了产生最大的种子数与到达每个柱头足够花粉粒数量关系。花粉传递效率越高，P/O应该越低，他回顾了96种植物物种的P/O比率，发现比率与有性生殖系统相关(r=0.947)，P/O比在闭花受粉的平均水平为4.7，专性自花授粉的为27.7，兼性自花授粉的为168.5，兼性异花授粉的为796.6，异花授粉的为5 859.2[15]。然而，一些兼性和专性异花授粉的物种，比如柳叶菜科、含羞草科、萝藦科是不遵循Cruden规则的，在柳叶菜科(407)，含羞草科(559)和萝摩科(7)低P/O比率被认为是通过聚集花粉提高花粉效率。柳叶菜科的一些花粉结成块，在含羞草和萝摩科中以花粉聚合的方式出现[16]。因此，随着花粉聚集体大小的增加，柳叶菜科、含羞草科和萝摩科的P/O比值降低。兰花也不遵循Cruden规则，在一些异花授粉的兰科植物中P/O比值3.9～24.0变化[17-18]；Nazarov等[11]研究表明兰科植物对应子房有大量的胚珠，花粉聚合成花粉块，P/O的值不同种类变化不大，而每个柱头上花粉的量不同种类变化大，相近种类的柱头面积与胚珠数量相关，软质和可分性的花粉，柱头面积越大，可接受的花粉越多，在不同属之间则相反，对硬质花粉，由于不可分，以全或无的方式进行授粉，兰花花粉量：胚珠量=1.2～3.2。本研究天麻花粉粒聚合成由两个花粉团组合成一个花粉块，不易切分(图1)，授粉量1/2与对照的种子干重都约为0.006 g，授粉量1/4和1/8的种子干重约为0.003 g和0.001 6 g，说明1/2的花粉块可以让天麻果实内部所有胚珠发育，并且授粉量1/4时的种子干重约为授粉量1/2的一半，1/8为1/4的一半，推测天麻的花粉数量与胚珠的数量比值接近2∶1，符合上述前人的研究结果。

兰科植物种子形态变化很大，Molvray[19]将种子分成5类：梭形或纺锤形、线状或丝状、棒状、椭球形及带翅状；Barthlott[20]仅将种子形态区分为3类：锯屑状、丝状和有翅的。就当前对兰科植物果实、种子和种胚研究而言，Shimizu等[21]研究了61种日本兰科植物，通过扫描电镜观察，大多数附生、生长在湿润陆地和林下明亮环境中的种子为椭圆形；一些生长在陆地黑森林中的种子极其长且窄，仅Galeolaseptentrionalis的种子为碟形，中央部分膨出；日本黑森林湿度大、风力弱，种子长且窄有利于散播，说明种子的形态与植物生长环境有关。Kiyohara 等[8]测量了68种日本兰科植物的种子和胚的大小，大多数种子的长度为0.3～2 mm，宽度为0.07～0.2 mm，种胚的长度和宽度分别为0.1～0.3 mm和0.04～0.2 mm。周元等[7]对不同授粉方式下的天麻果实、果实中种子和种胚的大小进行统计，研究表明该实验所选天麻的果实长度、宽度和重量分别为1.74 cm、0.92 cm、0.41 g， 种子的长度、宽度和果实中种子总重量分别为0.52 mm、0.13 mm、0.04 g，种胚的长度及宽度分别为0.17 mm和0.08 mm。杨文权[6]研究传统授粉方式(不去唇瓣)和改进授粉方式对天麻果实的影响，以观察这两种授粉方式对天麻的果实、种子及种胚的影响，研究表明红天麻果实长度、宽度和重量分别为1.68 cm、0.68 cm、0.34 g，种子长度、宽度分别为0.58 mm、0.14 mm，种胚的长度及宽度分别为0.17 mm和0.08 mm。本实验所测完整授粉的天麻果实长度和宽度、鲜重和干重、种子长度、宽度、种胚长度和宽度、果实中种子的净干重，与上述前人的研究结果类似，说明天麻果实和种子的发育很稳定，并且外界环境对天麻果实与种子的形态影响很小。

本研究以完整花粉块为对照，在解剖镜下将花粉块切分成1/2、1/4、1/8、1/16，于授粉后16 d对天麻果实和种子的各项数据进行测量，表明授粉量降低影响天麻果实大小和重量，但对种子和种胚的形态影响不大。完整授粉的天麻果实长度、宽度分别为1.56 cm、0.72 cm，鲜重和干重分别为0.23 g、0.03 g，种子长度、宽度分别为0.56 mm、0.13 mm，种胚长度、宽度分别为0.16 mm、0.10 mm，果实中种子的净干重为0.006 g，推测天麻的花粉数量与胚珠的数量比值接近2∶1，说明天麻的传粉效率极高，表明此方法可以作为研究其他兰科植物花粉数量与胚珠比值的新方法。