武夷山脉多花黄精多芽分蘖品种的选育

郭 娜，方文清，杨 斌

（1.福建生物工程职业技术学院，福建 福州 350003；2.邵武市南武夷中药材种植专业合作社，福建 邵武 350000）

黄精素有“长寿百岁仙草”之称，是国家卫健委公布的药食同源中药材之一，也是我国传统的大宗药材，用于滋补强身和治疗肾虚精亏、肺虚燥咳以及脾胃虚弱之症已有很长历史，是中医常用药物之一［1-2］。据《中国药典》规定可作为中药黄精使用的仅有滇黄精（Polygonatumkingianum）黄精（Polygo⁃natumsibiricum）和多花黄精（Polygonatumcyrtone⁃ma）3种植物的干燥根茎，分别习称为“大黄精”、“鸡头黄精”和“姜形黄精”。其中，多花黄精品种为公认的“品质最佳品种”。

福建省作为多花黄精野生资源的主产地之一，其人工栽培主要集中在福建北部的南平地区。笔者在调研中发现，传统多花黄精在人工种植过程中普遍存在：传统栽培品种单一、产量低、周期长、品质退化严重等情况。而且多花黄精的无性繁殖系数也较低，主要原因在于多花黄精前端3～4节进行发芽能力很强，所生成的植株较为旺盛，但尾部的节却很难进行发芽处理，即使发芽成功，生长质量也会受到影响［3］。因此，多花黄精在栽培上急需高品质的新品种进行更新，以增加种植效益。为此，本研究开展了多花黄精优良种源（产地）——优良单株二层次联合选种及无性快繁技术研究，初步筛选出多花黄精新品系，以推动闽北区域多花黄精产业发展。

1 试验地概况

多花黄精良种选育试验基地位于邵武市南武夷药博园。2019年邵武市凭借良好的中药材产业基础，被国家农业农村部认定为第二批国家中药材（多花黄精）区域性良种繁育基地。

2 材料与方法

2.1 实验材料

多花黄精的种质资源活株：分别从福建省南平地区的邵武、延平、顺昌、建瓯、松溪、光泽、浦城、建阳、武夷山、政和10个县市共迁地保护黄精种质资源176份。

样品的前处理：将不同产地的多花黄精分别编号并做好标记，然后用自来水进行清洗，去除泥土及杂质，然后放到电热恒温箱鼓风干燥箱，在50℃以下干燥一天。取出切成2～3 cm，再用中药粉碎机进行粉碎，过65目筛，装入密封袋，贴上产地标签备用。

2.2 试剂及溶液

无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、磷酸，均为分析纯，西陇化工股份有限公司；乙腈，色谱纯，美国新天地公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；蒸馏水，实验室自制。0.1%磷酸的配制：用移液枪移取1.17 mL磷酸于烧杯中，加入纯净水，稀释后配制至1 000 mL的烧杯，并转移到1 000 mL容量瓶定容。然后放入超声清洗机超声20 min，过0.45µm滤膜备用。

2.3 实验方法

2.3.1 技术路线

闽北区域多花黄精种群生态学调查→种质资源圃选址→种质资源收集及种质资源圃建设→优良种源地种质筛选→良种选育试验基地建设与管理→黄精多糖类化学成分指纹图谱构建→优良单株初步筛选→制定种苗质量标准→良种繁育体系建立→良种示范与推广。

2.3.2 黄精多糖类化学成分指纹图谱质量评价方法

多花黄精产品质量是种苗筛选研究的核心，而黄精多糖含量是多花黄精根茎的重要有效药用成分，也是衡量其药材质量的主要指标之一［4］。现代药理学研究也表明了黄精的活性成分主要为黄精多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎抗菌、调节血糖血脂、调节免疫、改善记忆力等功能［5-11］。因此，项目采用现代分析技术进行其指标成分检测，采用超临界二氧化碳流体萃取技术进行高效提取分离，以高效液相色谱——离子阱质谱离线联用模式，对比种苗试验基地的多花黄精对照品种的成分分析结果，开展多花黄精HPLC-MS、HPLC特征指纹图谱质量评价。

3 结果与分析

3.1 建立了3个多花黄精种群生态信息监测点，2个种质资源圃及其信息数据库

根据多花黄精品种选育技术路线，项目组在南武夷药博园内建立了多花黄精生态信息监测点3个，种质资源圃2个（占地面积30亩），分别对不同县市产地的多花黄精品种的主要生物学性状进行跟踪系统观测，进行了光、温度、水、土壤等因子对多花黄精的生态作用及适应的研究。同时，建立了与种质资源圃相匹配的“武夷山脉多花黄精种质资源信息数据库”，分别从形态、产量、品质、适应性及繁殖特性等方面开展种质评价，初步建成闽北区域多花黄精种质资源数据库。

3.2 不同产地HPLC指纹图谱检测

项目组在10个县市所收集到的176份多花黄精种质资源中，以其生长态势为主要参考值，选择出闽北区域8个不同县市产地的多花黄精，具体产地为：邵武市南武夷药博园、邵武市金杭、政和县外屯、武夷山市上梅、浦城县富岭、松溪县花桥、顺昌县洋口、光泽县司前，分别为图1的A、B、C、D、E、F、G、H。

为了进一步确认HPLC指纹图谱数据的准确性，分别对数据的重现性和稳定性进行了验证。即制取了8份等质量的样品，分别测定这8份多花黄精供试品溶液10号峰的峰面积，求它们的相对标准偏差（RSD）。综合图1、表1可见，10号峰较为稳定，峰值为1，RSD为0，分离效果最好。故选择第10个峰号作为良种筛选中多花黄精遗传稳定性指标的参照峰。

为提高数据的科学性，项目组对图1、表1的数据做了6次重复测试。其重现性情况见表2。由表2可知，重现性试验的RSD=0.69%（n=6），表明此样品的重现性良好。其稳定性情况见表3。由表3可知，稳定性试验的RSD=0.55%（n=6），表明制备好的多花黄精供试品溶液在12 h内稳定性良好。

表1 八批多花黄精的相对保留时间指纹图谱数据Tab.1 Relative retention timefingerprint data of eight batches of P.cyrtonema

表2 重现性试验结果一览表Tab.2 The list of reproducibility test results

表3 稳定性试验结果一览表Tab.3 The list of stability test results

图1 八批不同产地的多花黄精的高效液相指纹图谱Fig.1 HPLCfingerprints of P.cyrtonema from eight batches of different producing areas

同时为了证明该方法的可行性，对仪器精密度、稳定性、重复性等都进行检验，且实验中的精密性试验的RSD=0.40%（n=6），重现性试验的RSD=0.69%（n=6），稳定性试验的RSD=0.55%（n=6），即表明制备好的多花黄精供试品溶液在12 h内稳定性良好。

3.4 优良单株筛选

项目组对这8个种质资源再次进行相对峰面积指纹图谱测试，如表4八批多花黄精的相对峰面积指纹图谱数据所示。从表4可以看出，在8个产地中，B产地峰号0.940 1，C产地峰号0.933 5，H产地峰号0.834 5，与第10个峰号（参照峰）最为接近，8个产地中的B产地（邵武市金杭）、C产地（政和县外屯）、H产地（光泽县司前）三个产地的多花黄精遗传稳定性等指标相对稳定。经初筛完成后，该三个产地的品种转入实地栽培，进行产量及抗逆性等指标实验。

表4 八批多花黄精的相对峰面积指纹图谱数据Tab.4 The relative peak area fingerprint data of eight batches of P.cyrtonema

项目组建立栽培对比实验基地，从2017年2月至2020年10月，对B产地（邵武市金杭）、C产地（政和县外屯）、H产地（光泽县司前）的3个多花黄精种质资源多芽分蘖品系，开展了为期三年栽培实验，主要对该三个品系的生长特性、产量、黄精多糖含量、病虫害状况、抗逆性等指标进行跟踪测试，于2020年10月20日进行测产，测产数据见表5。

表5 三个产地测产数据Tab.5 The production measurement data of three producing areas

项目组对B产地，C产地和H产地3个多花黄精种质资源多芽分蘖品系，分别进行了产量、抗逆性，遗传稳定性等指标试验情况开展数据汇合、综合分析与评价，最终筛选出1个优质高产的多芽分蘖多花黄精品系，即B场地（邵武市金坑）多花黄精种质资源分蘖培育的品系，暂命名：武夷山1号多花黄精。并制定了《福建北部多花黄精多芽分蘖品系种苗繁育技术操作规程（SOP）》。

4 讨论

本研究为了选育优质高产的多花黄精种苗，建立了种群生态信息监测点3个，种质资源圃2个，为研究多花黄精的生态适应性、种苗筛选、繁育、抗逆性和遗传稳定性分析、种植基地建设等提供了科学依据。同时，本研究在开展黄精HPLC-MS、HPLC特征指纹图谱质量评价新方法研究过程中，为了进一步确认HPLC指纹图谱数据的准确性、科学性，分别对数据的重现性和稳定性进行了验证，而且还对仪器精密度、稳定性、重复性等都进行检验，故该指纹图谱较为完善，为人工栽培多花黄精提供重要的产品质量控制保障，也为从多花黄精种质资源圃中筛选出黄精多糖含量高、品质较好的种质资源提供有效的质量评价方法，也为多花黄精的医药使用及质量考察提供更为可靠的参考。

该研究采用了多芽型天然变异株系统选择纯化等方法，从10个县市所收集到的176份多花黄精种质资源中，以“品质、产量、抗性”为主要考核指标，成功培育出了多花黄精“一株多芽”型优良新品系1个，其主要表现为芽头多（从“单株生长”转变为“丛状生长”）、产量高（为“一株单芽”品种的11.4倍）、品质优（黄精多糖含量达17.7%，远高于《药典》规定的“不得低于7%”标准）、抗逆性强，并配套建立配套的良种繁育技术体系和生态栽培技术体系，具有巨大的推广应用价值。