金银花防治猪繁殖与呼吸综合征的潜在作用机制

马 力，宋延平，杨彦平，赵林涛

（1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医药研究院，西安 710003；3.西安雨田农业科技股份有限公司，西安 710065）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine productive and re⁃spiratory syndrome，PRRS），也称蓝耳病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的一种以猪繁殖障碍和呼吸症状为主的急性、强传染性疾病；目前在我国广泛流行，主要损伤猪肺泡巨噬细胞、降低机体免疫力、引起继发感染，仔猪发病后主要表现为耳廓发绀（俗称蓝耳病）、呼吸道症状、高热；怀孕母猪引起流产、产死胎或木乃伊胎［1］。目前该病以预防为主，但由于病毒传播速度快、毒株变异力强等问题，不能有效控制大面积地传播和流行，对生猪养殖业造成极大危害［2］。

近年来研究发现中药具有广谱抗病毒、增强免疫等作用，对PRRS的预防和治疗具有积极作用。张道广等［3］通过试验发现，绿原酸、黄芩多糖、板蓝根水提物等在体外抑制PRRSV增殖，对其具有较好的阻断和抑制作用；唐耀平等［4］对自行研制的中兽药方剂排毒逐瘀散与经典中兽药方剂清瘟败毒散、白虎汤对PRRS的防治作用进行了对比试验，结果显示，3种中兽药方剂对预防和治疗均有较好效果；黄德利等［5］将金银花等12味中药制成制剂，加入饲料中连用3天，与空白组相比，对PRRS有很好的预防效果。

金银花（LonicerajaponicaThunb.）自古以来就被誉为清热解毒的良药，性甘寒气芳香，清热而不伤胃，透达又可祛邪；既能宣散风热，还善清热凉血，近年来作为抗生素的替代品，逐渐被应用在畜禽养殖行业，防治多种畜禽疾病，效果显著［6］，然而关于金银花抗PRRS的基础研究较少，特别是对其作用机制及通路的研究。中兽药网络药理学以生物信息学为基础，结合多向药理学、分子网络数据以及计算机模拟分析等技术，通过构建中药-化学成分-靶点-通路-疾病之间的复杂网络关系，从整体的角度阐释中兽药的作用机制［7］。本文利用网络药理学分析方法来探讨金银花治疗PRRS的物质基础和靶点信息，为应用中药金银花及其提取物治疗PRRS奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 金银花潜在活性成分与靶点的收集

在 TCMSP 平 台（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］，利用口服利用度（OB）和类药性（DL）两个参数对金银花的潜在活性化合物进行筛选，设定其阈值为：OB≥30%，DL≥0.18［9］，为了避免遗漏潜在有效成分（已有文献证明其抗病毒的有效性），这部分活性成分也被纳入研究中。同时利用该数据库收集这些潜在活性化合物所对应的蛋白靶点，最后利用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），将靶点蛋白转化为对应的基因。

1.2 PRRS相关宿主靶点的获取

在CTD数据库（http：//ctd.mdibl.org）［10］中输入关键 词“Porcine Reproductive and Respiratory Syn⁃drome”，查询并收集PRRS相关宿主靶点基因，并利用Uniprot数据库将所得靶点标准化。

1.3 筛选交集靶点

利用在线Venny 2.1.0软件将金银花中主要活性成分作用的靶点与CTD数据库中获得的PRRS相关靶点进行映射分析，获得金银花防治PRRS的潜在作用靶点。

1.4 蛋白-蛋白互作网络图的构建与分析

潜在作用靶点导入String数据库（https：//string-db.org/）［11］，限定物种为“Sus scrofa”，构建PPI网络图；将蛋白质互作关系网络数据保存为“.tsv”文件导入Cytoscape 3.7.2［12］可视化，并利用其内置net⁃work analyzer分析工具分析网络特征参数，包括连接度中心性（Degree centrality，DC）、紧密度中心性（Closeness centrality，CC）、介度中心性（Betweenness centrality，BC）等，这些参数值越大，说明它们在网络中越重要，可能是金银花防治PRRRS的关键作用点。

1.5 “药物-成分-靶点-疾病”网络的构建与分析

将活性成分与对应的靶点基因导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，其中用“节点”（node）表示药物、成分、靶点和疾病，用“边”（edge）表示相互之间的关系；同时应用net⁃work analyzer子功能计算各个节点的重要属性值，筛选金银花抗PRRS的重要活性成分。

1.6 GO功能及KEGG通路富集分析

Metascape平台（http：//metascape.org）［13］可对靶点进行通路富集分析，整合了GO、KEGG、Uniprot等多个权威的功能数据库，对基因或蛋白质进行注释、富集分析，其中GO功能分析包括生物学过程（Biological process，BP）、分子功能（Molecularfunc⁃tion，MF）及细胞组分（Cellular component，CC）。将潜在作用靶点信息导入Metascape进行GO及KEGG分析，保存其结果并对其进行可视化。

1.7 分子对接

从Protein Data Bank（PDB，http：//www.rcsb.org）［14］下载关键蛋白结构，从ZINCdatabase（http：//zinc.docking.org/）［15］中找到主要活性成组分的三维结构。将改造后的蛋白和组分引入AutoDock Vina进行分子对接，在相同条件下进行分子对接模拟，两者结合能越低，构象越稳定，发生作用可能性越大。一般以结合能绝对值大于4.25说明具有结合活性，大于5.0表明有较好的结合活性，大于7.0说明具有强烈的结合活性［9］。选择构象最高、结合自由能绝对值最大的对接结果，并应用Pymol软件将对接结果可视化。

2 结果与分析

2.1 金银花潜在活性成分及靶点

利用TCMSP平台，根据设定的OB和DL值，从236个化合物中筛选出23个符合条件的化合物，通过查阅文献补充了5个具有药理活性的成分，例如，绿原酸（Heriguard，OB 11.93%）和咖啡酸酯（Caffeate，DL 0.05）是金银花抗病毒的有效成分，已被证实具有强大的抗病毒活性［16-17］。最终28个潜在活性成分（排除7个没有作用靶点的化合物）共获得470个蛋白质靶点；去重后，发现有220个靶点蛋白，经UniProt数据库转换成基因名。

2.2 PRRS的靶点获取

CTD数据库中共获取PRRS相关宿主基因744个。

2.3 金银花防治PRRS的靶点获取

将PRRS相关宿主基因与金银花潜在活性成分的靶点基因相互映射后，共筛得70个交集靶点，作为金银花防治PRRS的潜在作用靶点，见图1。

图1 药物与疾病交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagramof drug and disease intersection target

2.4 蛋白互作网络的构建与分析

将70个靶点基因导入String数据库，限定物种为“Sus scrofa”，分析数据导入Cytoscape 3.7.2软件构建靶点蛋白相互作用网络图（隐藏掉没有交集的靶点）。结果显示，该网络共涉及64个节点、657条边，如图2所示节点颜色越深越大，说明其在网络中越重要。将30个靶蛋白基因度值高于中位数（20.51）的列于表1，TNF、ALB、CASP3、IL6、IL10、MAPK14等靶点蛋白基因度值较大，表明这些靶点与其他靶点相互作用较强，正是药物作用于机体时发挥作用。

表1 金银花防治PRRS的靶点（度值大于中位数）Tab.1 Targets of honeysuckle for prevention and treatment of PRRS（degree value greater than median）

图2 蛋白-蛋白网络互作图Fig.2 Protein-protein network interaction diagram

2.5 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建与分析

将活性成分与对应的靶点基因导入Cytoscape 3.7.2软件，构建了金银花抗PRRS的“药物-成分-靶点-疾病”网络图。其中JYH代表金银花，PRRS代表疾病，主要的活性成分用蓝色的多边形表示，绿色的三角形代表关键靶点（如图3）。对化学成分进行度值计算，发现度值较高的槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、金圣草（黄）素等金银花的潜在活性成分可能是防控PRRS的关键成分（见表2）。

表2 金银花防治PRRS的关键成分及重要参数Tab.2 Key components and important parameters of Honeysuckle for prevention and treatment of PRRS

图3 药物-成分-靶点-疾病网络图Fig.3 Drug-component-target-disease network

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Metascape平台对70个交集靶点进行GO功能富集分析，根据P-value＜0.05筛选结果，如图4所示，7条生物过程条目主要涉及细胞凋亡信号通路、细胞增殖的负调控及细胞因子的正向调节作用等；7条分子功能条目主要涉及与转录因子、细胞因子、趋化因子、及NF-κB的结合，参与激酶调节活动和抗氧化活性等，6条细胞组分条目主要涉及胞浆核周区、内质网腔、核膜、树突及质膜蛋白复合物等。

图4 GO功能富集结果图Fig.4 GOfunctional enrichment resultsdiagram

同样地，也利用该平台对靶点进行了KEGG通路富集分析，共得到相关通路276条，删除明显与研究疾病不相关的通路（如癌症通路），保留富集基因最多的17条通路（P-value＜0.05），如图5所示，富集基因数目最多的通路集中于病毒感染（如卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、麻疹、朊病毒病等通路）、炎症通路（IL-17信号通路、炎症性肠病、趋化因子、坏死性凋亡、NF-κB信号通路等）、氧化反应相关的通路（p53、HIF-1信号通路）、细胞周期信号通路等。这些通路不但直接与抗病毒相关，而且在抗炎、氧化应激和免疫力调节方面发挥作用，因此推测这些通路可能是金银花防治PRRS的核心通路。

图5 KEGG通路富集气泡图Fig.5 Enrichment Bubble Diagram of KEGGpathway

2.7 分子对接结果及可视化

金银花中DC值最高的3个化合物（槲皮素、木犀草素和山奈酚）分别与治疗核心靶点一一进行对接，这些关键成分与核心靶点蛋白的结合能普遍较高，这进一步表明金银花可能通过多组分靶通路模式发挥治疗PRRS的作用，部分对接结果见表3和图6。

图6 分子对接可视化图Fig.6 Visualization of molecular docking

表3 分子对接结果Tab.3 Molecular docking results

3 讨论

本研究采用网络药理学和分子对接的技术对金银花的有效成分、作用靶点、生物富集通路等几个方面进行了深入探讨。

通过筛选获得的金银花中的有效活性成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡萝卜素、β-谷甾醇等，它们可能是金银花体内发挥药效的主要活性成分。槲皮素具有抗病毒、抗炎及抗氧化等广泛的生理活性［18］，研究者通过实验发现槲皮素能明显地抑制PRRSV病毒活性，可能是通过抑制病毒的复制而实现的［19］。木犀草素对PRRS在内的40多种病毒均有抑制作用，通过影响宿主细胞中的激酶和转录因子活性影响病毒复制，亦或利用其结构特异性阻断病毒与宿主细胞的结合而阻断病毒进入细胞；同时它控制多种炎症信号通路（NF-κB、MAPK/AP-1、JAK/STAT等）抑制炎性细胞因子和炎症介质的表达［20，21］。山奈酚可以通过减轻氧化应激反应和提高线粒体的功能，减轻囊胚自噬和DNA损伤的程度，对猪卵母细胞和猪繁殖发育具有良好的保护作用［22］。β-胡萝卜素由于其多烯烃结构而具有良好的抗氧化活性，实验发现其可以缓解早期断奶仔猪肠上皮细胞炎症和内质网应激反应而发挥抗炎、抗氧化和免疫调节功能［23］。在研究β-谷甾醇对断奶仔猪的影响中发现，良好的抗氧化能力能有效提高猪精子的体外获能和体外受精效果，通过降低TNFα、超敏反应C蛋白等的含量，促进外周淋巴细胞增殖，具有调节育猪机体免疫功能［24］。

PRRSV感染后导致猪体内炎症调节失衡，在感染晚期炎症因子大量表达，形成“炎症因子”风暴，这也是PRRSV极易导致猪死亡的重要因素［25］。金银花作用的靶点主要富集在炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、白介素6（IL6）和白介素10（IL10）等，PRRSV感染后，致炎因子（TNF、IL6、IL10）能促进白细胞聚集和活化，增加毛细血管的通透性并诱导发热、厌食、精神萎靡等一系列反应，引起支气管哮喘样症状［26-28］，作用于该类致炎因子可调控PRRSV感染后的一系列症状。另外，胱天蛋白酶3（CASP3）［29］是细胞凋亡途径的关键酶，也被称为凋亡的炎性介质，通过调控细胞凋亡信号通路和细胞增殖，在炎症反应中起重要作用。MAPK14是MAPKs家族的重要成员之一，在炎症等病理过程中起着重要的调控作用［30］。

KEGG富集通路结果分析发现，金银花作用于PRRS的通路与多种病毒感染有关，说明金银花主要成分和靶点作用于多种抗病毒通路，发挥广泛的抗病毒作用，多种炎症信号通路参与调节PRRS感染后炎症因子风暴的治疗。HIF-1信号通路参与免疫调节和抗氧化活性，作用于该通路有助于提高PRRS病猪免疫力和抗氧化活性。

综上，金银花主要活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚等，作用于与PRRS疾病相关的靶点基因TNF、ALB、CASP3、IL6、IL10、MAPK14等，主要调控病毒感染、炎症、氧化应激和免疫调节等信号通路发挥防治PRRS的作用，接下来还需进一步的动物试验来验证。