高效液相色谱法同时测定盐酸二甲双胍中5种杂质的含量

◎ 马金丽

（云南云测质量检验有限公司，云南 昆明 650500）

现阶段，全球范围内的糖尿病患者数量逐渐增多，其中90%以上的患者为2型糖尿病，这给医疗卫生产业带来了巨大负担。糖尿病患者需要长期借助药物控制血糖，从而降低相关并发症发生风险，延缓疾病进展[1]。盐酸二甲双胍是2型糖尿病治疗中常用的药物，这一药物的临床应用比较广泛，且降糖效果明显。目前市场上流通的盐酸二甲双胍有肠溶胶囊、缓释片和片剂等，因厂家较多、制剂种类差异较大，不同厂家生产的药物在质量上存在差异，尤其是一些杂质的存在，可能会在不同程度上威胁到人体的健康[2]。原料药是盐酸二甲双胍制剂研究的重要基石，为提升用药的安全性，需要展开盐酸二甲双胍原料药中的杂质分析。

对盐酸二甲双胍原料药合成工艺、降解途径进行分析，可知原料药中包含6种杂质，其中最常见的有5种，其结构见表1。为研究方便，分别将其命名为甲、乙、丙、丁和戊。目前，药典仅仅对第一种杂质的含量作出了限定，而对于其他杂质，并无明确限定。且杂质甲正电性不佳，于阳离子交换柱上通常难以保留，和溶剂倒峰分离的情况不佳[3]。若测量中流动相选取离子对比剂或纯水相磷酸二氢铵水溶液，可能损伤色谱柱，且检测成本较高[4]。为提升杂质检测的安全性及便利性，需要探讨一种新的检测方法。

表1 5种杂质的结构式表

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸二甲双胍对照品（批号为1169-100A1，其纯度100.0%）；杂质甲的对照品（纯度质量分数98.0%）；杂质乙的对照品（纯度质量分数98.8%）；杂质丙的对照品（纯度质量分数98.2%）；杂质丁的对照品（纯度质量分数100.0%）；杂质戊的对照品（纯度质量分数99.5%）；盐酸二甲双胍原料药（纯度质量分数99.4%）；磷酸二氢钾、磷酸、色谱纯的乙腈与实验室自制重蒸水。

1.2 仪器和设备

Waterse2695系统的高效液相色谱仪，配套检测器是Waterse2998二极管阵列检测器（美国Waterse2695系统）；CPA225D电子分析天平（德国赛多利斯）；SK2510HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；UV-1801型紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；精密pH计（PHS-3C，上海雷磁仪电股份有限公司）；电子分析天平（Sartorius BT-25S）。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

（1）制作供试品。准确称取0.5 g盐酸二甲双胍药物，在100 mL容量瓶中称定，用体积比为80∶20的乙腈-水溶液作稀释液，定容到刻度线后摇匀，获得供试品溶液。

（2）制作对照溶液。从供试品溶液中，准确量取0.1 mL，将之放在容量瓶中（容积为100 mL），以稀释液乙腈-水稀释到容量瓶的对应刻度，将之摇匀，获得对照溶液。

（3）制作杂质对照品储备液。称取含有杂质甲、乙、丙、丁和戊的盐酸二甲双胍对照品，甲杂质含量为2 mg，其他杂质含量均为1 mg。将之放在容量瓶内（容积为10 mL），加入适量重蒸水，将其溶解，稀释到相应刻度后摇匀，获得含杂质的对照品溶液，其中1 mL盐酸二甲双胍甲杂质含量为200 μg，其他杂质含量为1 mL盐酸二甲双胍杂质含量为100 μg。对其逐渐稀释，稀释倍数为10倍、100倍、1 000倍。

（4）制作系统适应性溶液。称取50 mg盐酸二甲双胍对照品，放于容量瓶（10 mL），用体积比为80∶20的乙腈-水溶液作稀释液将其溶解，精确量取0.05 mL含有杂质甲的对照品储备液，分别量取0.25 mL含有其他4种杂质的对照品储备液，将之放入上述容量瓶内，以稀释液定容至刻度线，将之摇匀，作为系统适应性溶液。

（5）制作混合杂质对照品溶液。从含有杂质甲的对照品储备液中，精密量取0.05 mL，从其他4种杂质对照品储备液中，分别精密量取0.25 mL，放到同一个容量瓶内（10 mL），加入稀释液至刻度线后停止并摇匀，获得混合杂质对照品溶液。

1.3.2 色谱条件

所 用 色 谱 柱 为 Ultimate HⅠLⅠC Amphion Ⅱ，为 250 mm×4.6 mm，5 μm。 所 用 流 动 相 为 乙 腈-25 mmol·L-1磷酸二氢钾，用磷酸对溶液的pH值进行调节，使其为3.50，所用体积比为80∶20。色谱柱的温度为45 ℃，每次进样量为20 μL。检测时所用波长为213 nm，流动相的流速为1.0 mL·min-1。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验

从前面制备的系统适应性溶液中取样，根据1.3.2色谱条件进样分析，对获取的色谱图做好记录。如图1所示，一级各杂质分离度均为2.0以上，而杂质甲保留时间（相对）是0.1。

2.2 精密度试验

从系统适用性溶液中，准确量取20 μL，进行6次连续进样。得到甲、乙、丙、丁和戊5种杂质的峰面积分别为0.64%、0.58%、0.52%、0.61%和2.1%，均在3.0%以内，说明这一检测方法下，仪器具有良好的精密度。

2.3 检测限分析

对各项杂质对照品储备液进行逐级稀释，从中精确量取20 μL，展开检测，杂质定量限∶信噪比是10；杂质检测限∶信噪比是3。分别制作杂质甲、乙、丙、丁和戊的定量限溶液，各制作6份。对各种溶液峰面积RSD进行计算。经过测量，杂质甲、乙、丙、丁和戊检测限分别是 11.84 μg·L-1、29.36 μg·L-1、10.76 μg·L-1、10.57 μg·L-1和 180.26 μg·L-1； 定 量 限分 别 是 39.35 μg·L-1、98.79 μg·L-1、36.57 μg·L-1、35.41 μg·L-1和 605.78 μg·L-1；各项杂质 RSD 是 1.6%、1.0%、1.8%、1.5%和0.72%。

2.4 稳定性试验

根据1.3.2中的色谱条件，量取盐酸二甲双胍混合杂质的对照品溶液，在室温下分别在放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h时，从其中精确称取20 μL溶液进行进样检测，对5种杂质的峰面积变化率（RE）和RSD进行测量。通过测量发现，在12 h内杂质对照品溶液中，各杂质峰面积变化率和RSD均为±3.0%范围内（见表2），说明混合杂质对照品溶液，在这一时间段内是保持稳定的。

表2 稳定性试验结果分析表

以相同方法对供试品的5种杂质进行检测，发现5种杂质的RE和RSD均为±3.0%的范围内，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

根据系统适用性溶液配制方法，配制系统适用性溶液共6份，根据外标法，对各项杂质含量的RSD进行计算，结果依次为0.51%、0.72%、0.75%、0.48%和0.85%，均在3.0%以内，说明这一检测方法具有优良的重复性。

2.6 回收率试验

采集盐酸二甲双胍原料药9份，精确称取后，放在容量瓶之中（10 mL），将稀释剂加入其中，超声下溶解，将杂质甲的储备液加入其中，加入量分别是0.04 mL、0.05 mL、0.06 mL，而其他4种杂质储备液分别采集0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL。以稀释剂将之稀释到对应刻度之后摇匀，将之制作为不同浓度的回收率样品溶液，共计9份。并根据外标法，对各种杂质不同浓度下平均回收率与RSD进行计算，具体结果见表3。各项杂质在不同浓度之下，回收率为92.9%～104.3%，RSD在3.0%以内，说明这一方法具有优良的准确度。

表3 回收率试验结果表（单位：%）

2.7 盐酸二甲双胍中所含杂质测定结果分析

对4个厂家制造的盐酸二甲双胍原料药中5种杂质的含量同时进行测定，先按照上述步骤，制作对照溶液，对检测灵敏度进行调整，确保主成分色谱峰峰高为满量程20%左右。精确量取20 μL系统适用性溶液、20 μL供试品溶液，按照1.3.2色谱条件，对样品进行测定，采取外标法对各种已知杂质含量进行计算。杂质检查的结果见表4。

对表4的测定结果进行分析，可知这4个厂家所生产的盐酸二甲双胍中，杂质甲含量在0.02%以内，而杂质乙、丙、丁和戊的含量，均比定量限小，总杂质含量低于0.2%。由此可见，4个厂家所生产的盐酸二甲双胍原料药中，杂质的含量均符合相关要求。

表4 4个厂家盐酸二甲双胍中所含杂质测定结果表（单位：%）

3 结论

在盐酸二甲双胍原料药物质分析中，各国的药典均提倡以磺酸基阳离子交换柱进行检测，而且只是对杂质甲展开含量限定[5-6]。但这一条件中，杂质甲出峰快，和溶剂峰的分离并不理想，因此笔者尝试其他方法来进行研究。

为对盐酸二甲双胍中5种杂质同时进行检测，可以通过阴阳离子交换色谱柱来实现。在选取流动相时，考虑到对色谱柱的损伤和检测成本，笔者选取亲水作用色谱，最终选择Ultimate HⅠLⅠC AmphionⅡ色谱柱。另外，在检测波长选择时，5种杂质在210 nm附近均存在紫外吸收情况，杂质甲为主要杂质，其最大吸收波长为213 nm，因此本研究选取这一波长来进行检测。

本文通过分析发现本研究的方法具有良好的系统适用性，各杂质和主药能够实现分离，而检测中的重复性、精密性、稳定性试验结果均理想。另外，在定量分析中，通过外标法来实施，其方法准确、简单。总体来看，高效液相色谱法同时测定盐酸二甲双胍中的5种杂质的含量方法可靠、结果准确，可推荐应用。