不同酵母发酵苹果冰酒香气成分分析

◎ 白启正，赵志聪，连 琛，安贵阳

（西北农林科技大学 园艺学院，陕西 咸阳 712100）

苹果冰酒是借鉴传统冰酒酿造工艺的经验，结合水果和果酒的特点，创新出的一种全新的果酒品种。加拿大对苹果冰酒的定义是通过发酵高糖度（白利糖度＞30%）的浓缩苹果汁，使其残余糖度≥130 g·L-1，酒精度在7%～13%的果酒。其生产过程不添加糖、酒精、人工色素或香料。冰苹果酒具有清香可口、甘甜醇厚、冷藏后甘甜爽口的特点[1-3]。酵母是酿造果酒的关键因素之一，不同的酵母菌株种类酶活性存在差异，对所处发酵条件环境的适应力不同，导致每个酵母菌种的特性不同，由其发酵产物代谢的糖、酸、甘油和香气成分也会有所不同[4-5]。在苹果冰酒生产过程中，需要选择具有优良性状的酵母，能产生足够的香气成分。在果酒的发酵过程中，酵母在利用糖转化生产酒精的同时，还会产生其他副产物，如甘油、高级醇类等[6-7]。这些代谢物包括有机酸、醇类、酯类、酮类、烷烃和胺类物质[8]。酵母菌株对苹果酒的香气物质有着重要的影响，酵母的选择是优化酿造工艺的重要组成部分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果，品种为延长红，产于陕西省洛川县西北农林科技大学苹果试验站。7种市售酵母如下所示。欧法朗斯低温发酵冰葡萄酒酵母（La Fruitee，以下简称La-Fu），法国Sofralab公司；欧法郎斯芳香型葡萄酒酵母（L’Eclatante，以下简称L-Ec），法国Sofralab公司；葡萄酒酿酒酵母F33（Actiflore F33，以下简称F33），法国LAFFORT公司；安琪葡萄酒果酒专用酵母RW（以下简称RW），安琪酵母股份有限公司；安琪葡萄酒果酒专用酵母SY（以下简称SY），安琪酵母股份有限公司；白葡萄酒酵母X5（Zymaflore X5，以下简称X5），法国LAFFORT公司；干白葡萄酒酵母X16（Zymaflore X16，以下简称X16），法国LAFFORT公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010 SE气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司；RDN-1000D-4型人工气候箱，宁波东南仪器有限公司；Uni Bloc电子天平，日本Shmadzu公司；HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛细管色谱柱，美国Agilent公司；SPME手柄、57329-U DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司；

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

冰苹果汁中分别接种7种酵母，综合比较苹果冰酒的理化和感官指标，筛选出适合洛川地区苹果冰酒发酵的酵母菌种。

1.3.2 苹果冰酒酿造工艺流程及操作要点

苹果酒发酵工艺为冰苹果带冰采摘→分选→破碎、榨汁→护色、杀菌→调糖、调酸→酵母活化、接种酵母→密封发酵→过滤、澄清→苹果冰酒。

（1）原料的采摘与分选。原料选自西北农林科技大学洛川苹果试验站延长红品种，在自然条件下结冰完成苹果糖分的富集（环境温度低于-10 ℃）。带冰采摘，去除霉烂果。

（2）冰苹果发酵汁的制备。冰苹果分选后，用旋转式去核机将冰苹果去核并切分为块状，再利用破壁机将原料在低温条件下榨汁，不加水（环境温度低于-4 ℃）。榨取后的冰苹果汁静置4 h，之后用12层纱布过滤2次，对得到的汁液进行糖度测定，此时Brix值为为23，通过调糖将Brix值调整为30；加入柠檬酸将发酵汁的pH调到3.5。

（3）果汁处理。向果汁中加入偏重亚硫酸钾（120 mg·g-1），偏重亚硫酸钾是一种食品抗氧化、抑菌剂，可为果汁中提供SO2，达到护色、抑菌的效果。

（4）酵母活化。将购得的7种酵母干粉按照酵母∶水=1∶10的比例加入35～40 ℃的纯净水，再加入3%的糖加速活化过程，轻轻搅拌后静置15 min，之后再次搅拌，待30 min泡沫丰富后酵母活化完成，加入果酒中。

（5）发酵过程。发酵温度20 ℃，酵母添加量为0.45 g·L-1，在密闭发酵瓶中进行发酵。

（6）终止发酵。以Brix值降到15为发酵终点，向果酒中加入120 mL/100 L偏重亚硫酸钾终止发酵。从第8 d开始每天测定Brix值，记录不同酵母发酵果酒发酵时间。

1.3.3 香气成分测定

吸取样品酒样8 mL于15 mL的微萃取专用萃取瓶中，加入2 g NaCl，加入内标溶液（稀释500倍的50 mg·L-1的三辛醇溶液），40 ℃条件下平衡15 min，插入已老化的萃取头顶空吸附30 min。萃取完成后，取出萃取头迅速插入气相色谱仪进样口在260 ℃条件下解吸3min。

1.3.4 仪器条件

（1）气相色谱条件。色谱柱为HP-ⅠNNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为He气（纯度99. 999%）；柱流量1 mL·min-1；进样口温度260 ℃。色谱柱升温程序为初始温度50 ℃，保持3 min，然后以3.5 ℃·min-1升至120 ℃，保持3 min；再以13 ℃·min-1升至260 ℃，保持3 min。采用不分流方式进样。

（2）质谱条件。电离方式EⅠ，电子能量70 eV；质量扫描范围30～500 amu；离子源温度240 ℃；接口温度240 ℃。

1.4 数据分析

依据保留指数法进行定性分析。利用自动质谱图解卷积和鉴定系统（Automatic Mass Spectral Deconvolution and Ⅰdentification System，AMDⅠS） 建立保留指数校正库，利用保留指数及NⅠST11质谱库，比对在同样极性色谱柱条件下测得的香气成分保留指数结果，从而进行定性。将定性结果依据可信度强弱进行分类并详细记录，确定各化学成分。采用峰面积归一法求得各香气组分在果实总体香气物质中的相对百分含量。试验采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同酵母发酵苹果酒挥发性香气成分的GC-MS分析

采用气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）提取7种酵母发酵苹果酒中的挥发性香气物质，结果如表1、表2所示。从7个酵母品种发酵酒中共鉴定出44种化合物，包括酯类19种，有机酸类5种，醇类13种，其他类7种，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、异戊酸己酯、辛酸乙酯、顺式-4-辛烯酸乙酯、癸酸乙酯、乙基-9-癸烯酸脂、十三烷酸乙酯、癸酸异戊酯、肉豆蔻酸乙酯、2-甲基丁酸、辛酸、异丁醇、正丁醇、异戊醇、正己醇、蘑菇醇、正辛醇、顺式5-辛烯-1-醇、苄醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、癸醛、草蒿脑及八甲基硅油这28种是7种酵母所发酵苹果酒共有的挥发性成分，但在不同品种酵母的发酵酒中含量有所差异。

表1 7种酵母发酵酒中香气成分测定结果表

续表1

表2 7种酵母发酵酒挥发性香气成分种类及相对含量表（单位：%）

2.2 不同酵母发酵苹果酒挥发性香气成分的种类和相对含量分析

在不同酵母品种发酵苹果酒中主要挥发性香气成分的种类和含量也有较大的差别。在7种酵母品种中，La-Fu所发酵苹果酒中挥发性香气物质种类最多，达到了39种，总相对含量达到93.94%，是7种酵母发酵苹果酒中挥发性香气物质相对含量最高的酵母品种；L-Ec酵母所发酵苹果酒中挥发性香气物质有37种，相对含量达到了91.10%；F33酵母所发酵苹果酒中挥发性香气物质有34种，相对含量达到了83.08%，是7种酵母发酵苹果酒中挥发性香气物质相对含量最低的酵母品种；RW酵母所发酵苹果酒中挥发性香气物质有36种，相对含量达到了88.99%；SY酵母所发酵苹果酒中挥发性香气物质有34种，相对含量达到了90.56%；X5酵母所发酵苹果酒中挥发性香气物质有32种，相对含量达到了90.98%；X16酵母所发酵苹果酒中挥发性香气物质有35种，相对含量达到了86.31%。

2.3 不同酵母发酵苹果酒中挥发性香气成分的分析

2.3.1 醇类物质

醇类化合物是在酒精发酵过程中酵母细胞分解氨基酸或糖类物质产生的次级产物，对果酒的香型起着重要作用[9]。在7组酵母发酵果酒中共检测到13种醇类化合物，La-Fu酵母发酵酒中醇类物质为13种，醇类物质种类最多，香气最为丰富。L-Ec酵母发酵酒中醇类物质为11种。F33酵母发酵酒中醇类物质有11种，醇类物质含量占比是7种酵母发酵酒中最高的，占香气物质的46.70%。RW酵母发酵酒中醇类物质有10种。SY酵母发酵酒中醇类物质有9种。X5酵母发酵酒中醇类物质有10种。X16酵母发酵酒中醇类物质有9种。高级醇不仅使蒸馏酒呈现香气还是醇甜和助香的主要物质来源。四氢薰衣草醇是La-Fu和L-Ec酵母发酵酒中特有的醇类香气物质，其具有薰衣草样花香香气，带有青草的辛香气息，丰富了这两种酵母发酵酒中香气组成。顺-4-癸烯-1-醇是La-Fu、L-Ec、RW 3种酵母发酵苹果酒中特有的醇类香气物质。在所有检测到醇类物质中含量占比最多的是异戊醇，异戊醇有苹果白兰地香气和辛辣味。我国GB 2760—2014规定其为允许使用的食用香料，主要用以配制苹果和香蕉型香精。La-Fu、F33和RW这3种酵母发酵酒中异戊醇含量较高，分别为34.20%、35.90%和35.27%，具有浓重的苹果香气。香茅醇和D-香茅醇具有甜玫瑰香，在La-Fu和F33两种酵母发酵酒中检测到了香茅醇和D-香茅醇，X5酵母发酵酒中含有D-香茅醇。

2.3.2 酯类物质

酯类物质是发酵酒中主要的呈味和呈香化合物，各种酯类具有不同的花香和水果香，如乙酸乙酯具有菠萝甜果味；丙酸乙酯有水果香；己酸乙酯有甜香、水果香、窖香；辛酸乙酯具有水果香气，并有菠萝、苹果样的香韵和白兰地的酒香味；壬酸乙酯有玫瑰香、果香、酒香；癸酸乙酯具有葡萄果香、脂肪香、酒香；肉豆蔻酸乙酯具有鸢尾油香、油脂味[10]。

酯类物质在7种发酵产物中共检测出19种，其中La-Fu有15种，相对含量占43.79%；L-Ec有16种，相对含量占49.13%；F33有15种，相对含量占30.46%；RW有18种，相对含量占41.42%；SY有18种，相对含量占56.93%，酯类物质相对含量在七种酵母发酵物中最多；X5有16种，相对含量占50.42%；X16有18种，相对含量占45.52%。酯类物质中含量较高的为正己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和乙基9-癸烯酸脂，相对含量见图1。酯类物质中含量最高的是辛酸乙酯，带来浓重的果香味与白兰地酒香味，7种酵母发酵酒中辛酸乙酯相对含量分别为18.52%、20.70%、12.96%、17.25%、24.31%、22.64%和18.82%。

2.3.3 有机酸类

有机酸类对苹果酒香气也有一定的影响，在7种酵母发酵酒中共检测到有机酸类物质5种。其中，La-Fu酵母发酵酒中5种物质都含有，总含量占2.665%；L-Ec酵母发酵酒中含有4种有机酸类物质，未检测出2,4-二甲氧基肉桂酸，总含量占1.84%；F33酵母发酵酒中有4种有机酸类物质，未检测出2,4-二甲氧基肉桂酸，总含量占2.56%；RW酵母发酵酒中检测出3种有机酸类物质，未检测出2,4-二甲氧基肉桂酸和异己酸，总含量占1.89%；SY酵母发酵酒中检测到3种有机酸类物质，未检测出2,4-二甲氧基肉桂酸和异己酸，总含量占1.61%；X5酵母发酵酒中只检测到2种有机酸类物质，2,4-二甲氧基肉桂酸、异己酸和乙酸都未检测到，总含量占1.08%；X16酵母发酵酒中检测到3种有机酸类物质，未检测出2,4-二甲氧基肉桂酸和异己酸，总含量占1.50%。有机酸类物质中含量最高的是辛酸，辛酸天然存在于苹果中，呈水果香气，可用于香料、杀菌剂的合成。

2.3.4 其他类物质

检测到的其他类物质包括烯烃类物质、酚类物质、酮醛类物质、醚类物质及烷类物质。在7种酵母发酵酒中共检测到7种其他类物质，其中，La-Fu酵母发酵酒中检测出6种，占1.96%，没有检测到壬醛；L-Ec酵母发酵酒中检测出6种，占2.21%，没有检测到3,5-二叔丁基苯酚，壬醛是该酵母发酵酒中特有的其他类物质；F33酵母发酵酒中检测出4种，没有检测到2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚，其余总量占3.27%；RW酵母发酵酒中检测出5种，没有检测到3,5-二叔丁基苯酚、壬醛，其余总量占1.37%；SY酵母发酵酒中检测出4种，没有检测到2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、壬醛，其余总量占0.71%；X5酵母发酵酒中检测出4种，种类和SY酵母发酵酒一样，总量占0.93%；X16酵母发酵酒中检测出5种，没有检测到2,4-二叔丁基苯酚、壬醛，其余总量占0.73%。

3 结论

大量的研究表明，不同的酵母因对于不同液体环境适应力与特性不同，在发酵时，可以使发酵酒体表现出不同的香气与口感，为酒体带来不同的复杂度与丰富度，给予酒体独特性。本研究表明，在不同酵母品种发酵苹果酒中主要挥发性香气成分的种类和含量也有较大的差别，La-Fu酵母所发酵酒中香气成分物质种类最多，相对含量占比最大，酯类、醇类物质相对含量较高，风味丰富，是酿造苹果冰酒的优秀酵母种类。