非酒精性脂肪肝与骨质疏松间的生物信息学关系

于洪杰 谭国庆

1.沧州市人民医院，河北 沧州 061000 2.山东中医药大学附属医院脊柱骨科，山东 济南 250014

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是极少酒精作用下发生的超过5 %的肝细胞脂肪变性，属代谢应激性肝损伤，已经成为主要公众健康问题之一[1]。其具体发病机制目前尚未明确，但普遍认为与胰岛素抵抗、氧化应激和脂质过氧化有关[2-3]。但随着研究的不断深入，越来越多证据表明肝脏与骨之间有着复杂联系，NAFLD更是能够通过多条通路影响骨骼发育成熟，临床研究表明NAFLD患者的腰椎、髋部等部位的BMD明显下降[4]。同时NAFLD与绝经后女性骨密度关系更为紧密，Lee等[5]经过回顾性横断面研究分析认为NAFLD是绝经妇女骨质疏松的高危因素。因此NAFLD与骨质疏松(OP)之间有复杂的联系, 且两者之间相互影响。本研究依据生物信息相关技术方法探讨非酒精性脂肪肝病与骨质疏松之间的可能作用机制。

1 材料和方法

分别以骨质疏松及非酒精性脂肪肝为关键词在相关疾病数据库( Disgenet、TTD、OMIM、Drugbank、Genecards)中筛选相关靶点，其中Disgenet筛选评分≥0.3 ，Genecards筛选相关度≥5。将两组基因通过uniprot数据库转换成uniprot ID进行去重整合，获得已明确的疾病靶点。然后将两组靶点映射取得韦恩图，将得到的关键靶点通过string数据库制作靶点间相互作用PPI网络。将PPI网络TSV格式导进Cytoscape3.7.2，筛选节点连接度(degree)制作核心靶点图。通过基因功能注释DAVID 数据库进行GO(Gene Ontology)生物过程富集分析以及 KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析使基因信息可视化，分别将筛选出的前20个GO条目与KEGG条目，依据Omicshare云平台制作高级气泡图。

2 结果

经过基因库搜索、转换ID整合后共选出与骨质疏松症和非酒精性脂肪肝相关基因 875 个和952个。映射出关键靶点217个，生成韦恩图(见图1)。经string数据库在0.7高信度下生成相互作用PPI网络(见图2)，其中有202个节点，208个靶点间具有1 280条相互作用关系。平均节点连接度(degree)为17.6，以筛选节点连接度(degree)≥36筛选到核心靶点24个(如图3)，所获核心靶点均直接或间接影响非酒精性脂肪肝与骨质疏松。经DAVID 数据库获得78项GO富集结果(P<0.05)及78条KEGG信号通路(P<0.05)，以P值升序排列，分别筛选出符合条件的20个生物过程和信号通路，并将其以气泡图的形式展现出来(见图4、图5)。通路下所含靶点分别见表1。

图1 非酒精性脂肪肝与骨质疏松映射关键靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of key targets for NAFLD and osteoporosis mapping

图3 核心靶点图(核心靶点大小为degree大小)Fig.3 Diagram of the core target (the size of the core target is degree size)

图4 GO富集分析气泡图(前20条)Fig.4 Bubble diagram of GO enrichment analysis (first 20)

图5 KEGG通路分析气泡图(前20条)Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway analysis (first 20)

表1 KEGG通路下所含靶基因(前20条)Table 1 Target genes contained in KEGG pathway (first 20)

3 讨论

经过相关基因数据库查重整合后发现NAFLD和OP均含有大量基因靶点，更说明这是两种相对复杂的代谢性疾病，且在PPI相互作用网络0.7高信度下具有1 780条相互作用关系，众多靶基因间具有复杂的相互作用关系使两种疾病发生密切联系，其中白介素6(IL-6)、胰岛素(INS)、 血管内皮生长因子(VEGFA)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)等核心靶点可能是两者相互影响的重要节点。IL-6、TNF是生物学效应广泛的细胞炎性因子，绝经后妇女体内雌激素水平下降，导致雌激素抑制成骨细胞生成TNF-α能力减弱，TNF-α的增加进一步刺激成骨细胞产生IL-6，发挥抑制成骨、促进破骨的作用[6]。IL-6、TNF-α等促炎因子的分泌导致NAFLD容易进展成为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[7]。有研究[8]认为NAFLD患者存在肠道菌群紊乱、致病菌增多等情况，引起体内炎症反应，使IL-6、TNF-α等促炎因子水平升高，诱发骨质疏松。促炎性细胞因子是NASH病理的重要介质，研究证实NASH患者中IL-6水平升高，且除参与炎症作用外，IL-6、TNF-α等还通过胰岛素抵抗、脂质代谢参与NASH的发生发展[9]。INS在骨质疏松进程中具有重要作用，一方面作用于成骨细胞表面受体，上调成骨细胞活性；另一方面调节血糖水平，抑制高糖对成骨细胞的毒性作用[10]。胰岛素主要调节体内糖脂代谢，高糖除增加TNF-α、IL-6的表达外，胰岛素抵抗引起代谢障碍产生脂肪积累，肝细胞内过度脂肪积累通过炎症应激等过程导致糖脂毒性，引起脂肪变性最终诱发NAFLD[11]，因此NAFLD常伴有肥胖、糖尿病等并发疾病。有研究[12]显示缺氧对大鼠成骨细胞的骨形成能力起到抑制作用，VEGFA能够调控血管内皮细胞的增殖和分化，增加小静脉血管与微血管的通透性[13]，从而增加供氧，缓解缺氧状态。同样血管构建也伴随在NAFLD的发生发展过程，肝窦毛细血管化是NAFLD的早期形态学变化[14]，因此通过靶向抑制肝窦脉细血管内生成有助于延缓NAFLD发展。有关数据表明, VEGF对于肝脏内血管形成及肝内皮细胞增殖有调控作用[15]，因此针对性抑制VEGFA有助于促进NAFLD的良好预后。推测NAFLD临床治疗过程中可能选择性的抑制VEGFA的表达，加重了体内缺氧环境，导致成骨能力减弱，促进OP的发生发展。PI3K/Akt信号通路是参与骨质疏松的经典通路之一，TAK1是其下游重要靶激酶，在骨形成中发挥重要作用。有研究[16]发现, 地塞米松能够间接活化TAK1诱导成骨细胞及骨细胞的凋亡, 而TAK1抑制剂能够抑制这种作用。AKT还是胰岛素发挥生物学功能的作用底物，促进脂肪、肝脏等对葡萄糖的摄取[17]。AKT磷酸化可以有效调节糖脂代谢改善胰岛素抵抗，胰岛素抵抗在NAFLD进程中具有重要作用。综上所述，骨质疏松与非酒精信号脂肪肝具有紧密联系，众多核心靶点主要围绕炎性反应及糖脂代谢等相关生理过程，这可能是二者发生联系的相关内在机制。

通过核心靶点富集分析可以发现诸多靶点通过调控多条通路发挥作用，其中主要在于乙肝通路、类风湿关节炎通路、TNF通路、IBD通路等多条信号通路。乙肝是临床常见具有传染性慢性肝病之一，当合并其他代谢性疾病是会增加NAFLD风险。有研究认为乙型肝炎和NAFLD具有协同作用，可加重肝脏损伤，因此预防二者协同作用具有重要意义[18]。而骨质疏松作为乙肝的常见并发症越来越受到重视，一项36 146例乙肝患者临床资料总结研究发现，乙肝患者骨质疏松率高于对照组1.13倍[19]，其作用机制除传统核因子-κβ受体活化因子配体-核因子-κβ受体活化因子-护骨素系统外，还可通过钙磷代谢、炎症反应等影响骨质疏松的发生[20]。类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，一项队列研究发现类风湿性关节炎与肝脏疾病相关，特别是非酒精性脂肪肝[21]，其作用机制可能与炎症反应有关。这类反复炎症也可导致全身骨量降低[22]，可能源于TNF、IL-6等细胞因子的激活，炎症诱导骨吸收。二者可通过多种炎症性疾病通路中靶点进行相互影响。HIF-1信号通路是VEGF表达的核心因子[23]，通过上调VEGF表达促进血管内皮细胞增殖，发挥VEGF在骨质疏松及NAFLD中的生理学效应。TNF、IBD、FoxO信号通路均是由炎症反应诱导，涉及多种炎症因子，调控骨质疏松及NAFLD进程。FoxO信号通路还可以调控氧化应激、葡萄糖和脂质代谢紊乱等过程[24]，这些炎症及糖脂代谢过程均与骨质疏松、NAFLD息息相关。有研究[25]显示, 当FoxO1鼠肝脏FoxO1过度表达会累积游离脂肪酸，促进肝脏细胞脂肪变性。虽然目前尚缺少研究探寻通路同时对两种疾病的影响，但不可否认上述通路从各个方面协同作用，产生不同生理过程来协调骨质疏松与NAFLD关系。

本研究通过对多个数据库进行基因信息整合，发现了两组疾病复杂而庞大基因网络中的交集部分，并发现了糖脂代谢及炎症反应在两种疾病间扮演的重要角色，考虑与脂肪毒性有关，但需进一步试验验证。