持续激活β连环蛋白对老年和成年小鼠骨量影响的研究

周晓英 宗兆文 鲍全伟

1.中国人民解放军陆军军医大学高原军事医学系高原生理学与病理学教研室，重庆 400038 2.中国人民解放军陆军军医大学陆军卫勤基地战救技能培训教研室，重庆 400038 3.中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院急诊科，重庆 400037

骨量下降、骨骼退行性变、并发骨折导致老年人死亡风险增加[1-2]。Wnt/β-catenin信号通路参与体内多种细胞生理的调节，在成骨细胞的成熟、分化，骨质量调节，关节炎发生发展过程中均起到不可替代作用[3-5]。研究显示众多抗骨质疏松药物调节骨量直接或间接通过该信号通路来实现，针对该信号通路的药物用于骨质疏松的治疗也取得了一定疗效。但目前尚未有报道激活该信号通路后老年小鼠与成年小鼠骨量增加的特点，本实验拟将在成年与老年小鼠中激活该通路并对骨量增加的作用进行对比探讨。

1 材料和方法

1.1 基因小鼠的激活

选取4月龄与18月龄基因型为3.2Cre；Catnb+/lox(exon3)小鼠各6只作为成年组与老年组，并选取相应年龄段同窝WT小鼠各6只作为对照组。注射他莫昔芬，激活小鼠成骨细胞内β-catenin。药物注射方式：腹腔注射；浓度为：TM75 mg/kg；频次：2次/周；注射时长：4周[6-8]。激活小鼠表示以CA-β-catenin命名。

1.2 CT图像采集

采用小动物CT成像系统对小鼠胫骨标本进行扫描，并分别计算骨体积(BV，mm3)占组织总体积(TV，mm3)的百分比(BV/TV，%)，骨小梁数目(Tb.N)，骨小梁分离度(Tb.Sp)，骨小粱厚度(Tb.Th)[9]。

1.3 HE染色

将标本制作4 μm石蜡组织切片。染色具体方法为：①脱蜡；②切片上滴加苏木精染液，约50 μL，染色时间为2 min；③滴加伊红染色液，约50 μL，1 min。

1.4 免疫组化染色

染色具体流程为：①消除过氧化物酶：滴加专用复合液，每个标本约为50 μL，时间不小于5 min；②抗原修复：清洗后滴加抗原修复液，每个标本约为50 μL，时间不少于30 min；③血清封闭：清洗后滴加血清封闭液，每个标本约为50 μL，时间20 min，不洗；④每个标本滴加TNAP一抗，平均每个标本约50 μL，然后于湿盒内反应，4 ℃时间大于16个小时；⑤将湿盒拿出置于37 ℃孵箱内复温，时间不少于60 min；⑥滴加相对应的二抗，每个标本约50 μL，37 ℃，1 h；⑦SABC液，37 ℃，30 min，PBS清洗；⑧显微镜下显色观察。

1.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色

染色步骤：①萘酚AS-BI磷酸盐溶液100 μL，37 ℃、45 min；②基础孵育液添加5 %副品红及4 %亚硝酸钠，孵育2～3 min；③封片观察[8]。

1.6 小鼠血清学生化检测

收集小鼠血清，血清采集方法为：①摘除小鼠眼球，挤压小鼠腹部用1.5 mL EP管收集小鼠血液；②将收集样本静置；③等待样本凝固后离心机上1 500 r/min，10 min；④另取EP管，将离心后的上清收集备用。运用小鼠骨特碱性磷酸酶ELISA试剂盒以及小鼠Ⅰ型胶原N端肽ELISA试剂盒检测骨形成及骨吸收指标的血清含量[8]。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 成年与老年组中CA-β-catenin小鼠相比于野生小鼠骨量均增多

实验发现各年龄段中CA-β-catenin小鼠的骨量均多于同组的野生型小鼠(图1)。HE染色结果，提示成年与老年组中CA-β-catenin小鼠胫骨干骺端骨髓腔内骨小梁均较野生型增加(图1a～d)；将小鼠胫骨干骺端行CT二维扫描，并计算骨量，结果发现不论成年还是老年组中CA-β-catenin小鼠干骺端骨小梁数目(Tb.N)，骨组织体积比(BV/TV，%)，骨小粱厚度(Tb.Th)均较WT小鼠增多(P<0.01)，以上结果均提示持续激活β连环蛋白后小鼠骨量会增加。骨量的多少通常由成骨与破骨的平衡所决定，非组织特异性的碱性磷酸酶(non-tissue specific alkaline phosphatase，TNAP)，可用来反映成骨细胞活性，针对TNAP免疫组化染色结果提示各年龄段中CA-β-catenin小鼠TNAP阳性成骨细胞数量均多于同窝WT 小鼠(图2a～d,i)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)结果提示各年龄段中CA-β-catenin小鼠破骨细胞数量均少于同窝WT 小鼠(图2e～h,j)。ELISA实验结果提示各年龄段中CA-β-catenin小鼠骨形成指标ALP均高于同窝WT 小鼠(图2k)，而骨吸收指标CTCX1均低于同窝WT 小鼠(图2 l)。

注：a～d：各组小鼠HE染色结果；e～h：各组小鼠CT扫描二维图片；i～l：CT数据分析统计结果。** P<0.01，放大倍数：40×。图1 各组小鼠骨量变化Fig.1 Changes of bone mass in mice in each group

2.2 不同年龄组中CA-β-catenin小鼠骨量增加有差异

虽然在成年组和老年组持续激活β-catenin后其骨量都比WT小鼠有增加，但老年CA-β-catenin小鼠与成年CA-β-catenin小鼠相比，骨量增加特点却不尽相同。持续激活β-catenin后，成年CA-β-catenin小鼠总骨量明显多于老年CA-β-catenin小鼠(图3a～c)，但将成年及老年组CA-β-catenin小鼠小鼠注射激活β-catenin药物前后对照可发现老年组CA-β-catenin小鼠骨量增加幅度ΔTb.Th、ΔBV/TV、ΔTb.N比成年组更大(图3 d～h)，分析破骨细胞染色结果可发现老年组CA-β-catenin小鼠破骨细胞数量多于成年组CA-β-catenin小鼠(图3i)。

注：a～c：成年与老年组中CA-β-catenin小鼠骨量对比；d～g：成年与老年组中CA-β-catenin小鼠激活β-catenin前后骨量变化对比；i：成年与老年组中CA-β-catenin小鼠破骨细胞数量对比。*P<0.05。图3 CA-β-catenin小鼠骨量变化分析Fig.3 Analysis of bone mass changes in CA-β-catenin mice

3 讨论

近年来，骨质疏松有年轻化趋势，各个年龄阶段均有可能罹患骨质疏松，整体形式严峻。目前针对骨质疏松的药物治疗方案有抗骨吸收及促进骨形成。然而对不同年龄段骨质疏松治疗方案选择尚缺乏有力基础研究支持。本研究比较了成年与老年小鼠中激活Wnt/β-catenin信号通路后对骨量变化的影响。

Wnt/β-catenin被证实与骨发育及骨量相关[6-8]，当Wnt/β-catenin信号通路激活时，β-catenin作为信号分子可进入细胞核，促进成骨细胞分化相关的基因表达如：ALP、OSX等[10-11]。以往的研究证实3.2kbCol 1 Cre表达于成骨细胞内，可特异性敲出锚定的基因[6-7]。在本研究中，运用3.2Cre；Catnb+/lox(exon3)小鼠可于成骨细胞中特异性激活β-catenin。

本研究发现激活β-catenin后成年及老年小鼠TNAP阳性细胞数量均上升，血清中ALP活性均上升。Wnt/β-catenin信号通路除了可以调节成骨细胞生理活动，还可以通过成骨细胞分泌OPN调节破骨细胞活性[12-14]。研究发现激活β-catenin后成年及老年小鼠TRAP阳性细胞数量明显下降，血清中CTCX1活性明显下降，这些骨形成指标上升、骨吸收指标下降，共同导致激活β-catenin后小鼠骨量增加。虽然持续激活β-catenin使小鼠骨量增加，但也发现在持续激活β-catenin前后各组小鼠自身骨量变化对比发现老年组CA-β-catenin小鼠骨量变化幅度较成年CA-β-catenin小鼠大。进一步分析发现老年组CA-β-catenin小鼠总骨量低于成年CA-β-catenin小鼠，这可能与老年组CA-β-catenin小鼠破骨细胞数量多于成年组CA-β-catenin小鼠有关，因年龄导致老年组CA-β-catenin小鼠破骨细胞活性强于成年组CA-β-catenin小鼠，导致骨吸收强于成年组CA-β-catenin小鼠。以上研究提示在老年性骨质疏松治疗时需同时促进骨形成与抑制骨吸收才能达到最佳效果。

现临床治疗骨质疏松主要是运用抗骨吸收药物，该类药物只能抑制骨不继续吸收，无法促进新骨形成。现有通过批准的骨合成代谢药物只有重组甲状旁腺激素(rPTH，特立帕肽)，然而这种药物因为延长治疗时间可能会增加罹患肿瘤的风险，因此在使用2年后必须停用，这限制了其长期运用[15]。Wnt/β-catenin信号通路相关药物可同时促进骨形成及抑制骨吸收，貌似给了我们一条不错的前景，但通过我们研究发现，对于老年小鼠增强Wnt/β-catenin信号后成骨细胞及骨形成指标上升，破骨细胞及骨吸收指标下降，但相较于成年小鼠其破骨细胞数量及骨吸收指标仍然较高，这对于临床治疗有着重要指导意义。

通过我们的研究发现针对老年性骨质疏松运用Wnt/β-catenin信号通路相关药物可以取得较好效果，但仍需关注老年自身高骨吸收。