LncRNA SNHG1下调miR-195-5p改善软骨细胞凋亡和炎症微环境

刘百奇 车德馨 侯庆露 王典 徐东辉

齐齐哈尔市第一医院骨外科，黑龙江 齐齐哈尔 161005

骨性关节炎(OA) 是一种由多因素相互作用导致关节软骨完整性受损，累及软骨下骨和关节边缘骨赘形成的关节疾病[1]。其发病机制与软骨细胞中炎性因子过度释放营造的炎性微环境和细胞凋亡有关[2]。目前尚无治愈OA的方法，通过寻找OA相关的病理调控基因，探索OA病程中潜在的分子靶目标，有助于找到OA的分子治疗途径。

长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)参与多种生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应等[3-4]。小核仁RNA宿主基因1 (SNHG1)是一种位于染色体11q12.3的新型lncRNA。研究表明，SNHG1的功能障碍与人类疾病的发生、发展有关，如骨肉瘤、骨肉瘤、结直肠癌、肝癌等[5-6]。在一些疾病中，SNHG1能够与某些miRNAs结合调控基因的表达[7-8]。长链非编码RNA-微小RNA(LncRNA-miRNA)高度参与机体生理病理的分子调控网络，LncRNA作为上游主导基因，充当miRNA负调节的分子海绵，参与OA等疾病的进展[9-10]。研究表明SNHG1通过激活miR-16-5p介导的p38 MAPK和NF-κB信号通路，能缓解IL-1β-诱导的OA炎症[11]。这提示SNHG1可能参与OA发生、发展的过程。

miR-195-5p在OA患者关节软骨组织和LPS刺激的ATDC5细胞中均显著上调，miR-195-5p抑制剂通过调控Wnt/βcatenin和NF-κB信号通路，抑制软骨细胞凋亡和炎症反应，对OA具有保护作用[12]。多项研究中miR-195-5p被证明受LncRNA SNHG12或XIST调控，在骨肉瘤的分子机制中发挥调节作用[13-14]。我们在starbase数据库中发现SNHG1和miR-195-5p二者存在潜在靶向位点。有报导称SNHG1和miR-195-5p在肝细胞癌与结直肠癌中存在靶向调控关系[15]。Zhang等[16]报道了SNHG1通过抑制miR-195-5p的表达来抑制肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和转移。目前尚未有文献报道二者在OA病理机制中作用，我们猜想存在SNHG1-miR-195-5p调控介导软骨细胞的凋亡与炎性微环境，报道如下。

1 材料和方法

1.1 软骨组织标本收集

在2017年10月至2019年10月期间，共收集OA及非OA患者标本各52例，OA患者年龄(58.9±5.3)岁，包括30例男性，22例女性。非OA患者年龄(59.3±4.8)岁，包括28例男性，24例女性。纳入标准：年龄18～65岁，参照2003年美国风湿病学院(ACR)诊断。排除标准：合并恶性肿瘤及其他骨关节病，存在感染、妊娠及哺乳期，合并严重肢体功能障碍者。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 软骨细胞培养、转染和OA细胞模型的建立

购买人软骨细胞C-28 / I2(北京北纳创联生物技术研究院)，培养于含有10 %PBS的DMEM培养基(上海康朗生物科技有限公司)中，在37 ℃，5 % CO2的环境下进行培养。采用Lipofectamine? 2000试剂盒(杭州沃森生物技术有限公司)对软骨细胞进行转染，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。其中，主要转染物有SNHG1过表达质粒即促进剂(SNHG1)、空载体质粒(pcDNA3.0)、miR-195-5p抑制剂(inhibitor)、miR-195-5p模拟物(miR-195-5p)、miR阴性对照(miR-NC)(广州复能基因有限公司)。转染24 h后，通过RT-qPCR验证转染效率。OA模型建立[17]，是将细胞置于5 μg/mL脂多糖(LPS)(上海恒渡生物科技有限公司)环境中，37 ℃干预5 h。未进行LPS干预的细胞作为对照。

1.3 动物模型的建立

采购SD大鼠[雌性，体重(225±25)g](上海弗尔博生物科技有限公司)，依据饲养标准进行饲养，经本院动物保护委员会批准。改良Hulth法建立OA大鼠模型[18]，在全麻下，经膝内侧切口，打开关节腔，切断前交叉韧带并切除内侧半月板等步骤，通过内、外侧应力试验和前抽屉试验来验证手术是否成功。对照组为假手术组，只打开关节腔。术后强迫大鼠活动，术后3周对模型组大鼠关节内分别注射SNHG1促进剂(SNHG1)、miR-195-5p抑制剂(inhibitor)(60 mg / kg体重，持续3 d)，单纯模型组与对照组注射生理盐水。大鼠分为对照组(n=10)、模型组(n=10)、模型组基础上SNHG1干预组(SNHG1，n=10)、模型组基础上inhibitor干预组(inhibitor，n=10)。最后一次注射后2周，对大鼠施行安乐死，收集软骨组织。

1.4 实时定量PCR

Trizol试剂(杭州新景生物试剂开发有限公司)提取细胞中的总RNA，以反转录试剂盒(北京杰辉博高生物技术有限公司)进行反转录，转录后对合成的互补DNA进行扩增。引物设计(无锡怀信生物医药科技有限公司)。mRNA使用β-Actin作内参，miRNA使用U6作为内参，相对表达量以2-△△Ct进行分析。

1.5 细胞凋亡检测

收集转染后软骨细胞，经PBS(北京华迈科生物技术有限责任公司)洗涤后添加了含FITC(2 μL)(上海金穗生物科技有限公司)与PI(5 μL)(北京凯瑞基生物科技有限公司)500 μL的结合缓冲液并放置于阴暗环境中，1 h后流式细胞仪(北京安麦格贸易有限公司)测量细胞凋亡率。

1.6 酶联免疫吸附测定(ELISA)

通过ELISA试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)测定人软骨细胞、大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6、TNF-α，严格按照操作说明书进行，最后实用酶标仪(北京安麦格贸易有限公司)在450 nm处测量吸光度。

1.7 细胞增殖检测

以MTT试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)进行检测，先接种细胞于96孔板(密度：5×104个细胞/孔)，在不同孵育时间向每孔添加20 μL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，接着逐个孔混入150 μL的DMSO，震荡10 min，最后酶标仪在450 mm的波长下测量吸光度值。

1.8 蛋白质印迹分析

通过RIPA缓冲液(北京欣华绿源科技有限公司)分离细胞组织中的蛋白，经10 %SDS-PAGE(南京恩晶生物科技有限公司)电离后转PVDF膜(北京凯瑞基生物科技有限公司)，使用封闭液(上海恒斐生物科技有限公司)封闭1 h。再使一抗与膜在4 ℃温育过夜，一抗包括IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3、Bax、Bcl-2以及β-Actin(北京百奥莱博科技有限公司)。将样品与HRP偶联的二抗(上海伯乐生命医学产品有限公司)在37 ℃杂交。最后，通过化学发光试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)分析蛋白条带。

1.9 双荧光素酶报告检测

将野生型(Wt)与突变型(Mut)的SNHG1、miR-195-5p片段的互补DNA片段亚克隆到荧光素酶报告载体中荧光素酶基因下游。将上述SNHG1片段与miR-195-5p或miR-NC共转染，48 h后，用双荧光素酶报告试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)连续测定细胞裂解物中荧光素酶活性。

1.10 RNA免疫共沉淀

通过EZMagna RIP试剂盒(上海谷研实业有限公司)进行测定。细胞经过裂解，与蛋白A磁珠、一抗孵育 1 h，再在4 ℃免疫沉淀8 h。最后，提纯RNA后检测SNHG1、miR-195-5p表达量。

1.11 RNA下拉实验

分别用生物素化miR-195-5p-Wt、miR-195-5p-Mut和Bio-NC(阴性对照)，转染于软骨细胞。48 h后，孵育细胞裂解物与M-280链霉菌磁珠，检测与珠子结合的RNA复合物中SNHG1的水平。

1.2 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0软件处理数据，数据以均值±标准差表示，所有实验均进行至少3次。应用独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、重复测量方差分析、Bonferroni检验进行分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。Pearson相关系数检验SNHG1、miR-195-5p相关性。

2 结果

2.1 SNHG1在OA中下调，而miR-195-5p在OA中上调

SNHG1在OA患者软骨组织中下调，而miR-195-5p在OA患者软骨组织中上调，二者在大鼠OA模型中也具有相似表现。相关性分析发现，二者还具有显著负相关(r=-0.713，P<0.001)。见图1。

注：A～B：在OA患者软骨组织中SNHG1水平较低，miR-195-5p水平较高；C：在大鼠OA模型软骨组织中SNHG1低表达，miR-195-5p高表达；D：在OA患者软骨组织中，SNHG1与miR-195-5p呈负相关。与对照组或两组比较，**P<0.01，***P<0.001。图1 SNHG1、miR-195-5p的表达Fig.1 Expression levels of SNHG1 and miR-195-5p

2.2 SNHG1过表达可降低软骨细胞中LPS诱导下细胞的高凋亡率并改善炎症微环境

细胞分析显示，LPS诱导下，软骨细胞的凋亡水平以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达以及蛋白水平显著上升，细胞增殖能力受到明显抑制。通过转染过表达质粒到软骨细胞中，实现SNHG1的过表达后，以上软骨细胞的表现得到显著改善，但是和对照组相比还具有显著差异。以上结果均具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A：SNHG1转染效率；B：LPS诱导下软骨细胞的凋亡率显著提高，而SNHG1可抑制细胞凋亡水平，及其流式细胞图；C～D：LPS诱导下软骨细胞的炎症因子表达与蛋白水平均显著提高，而SNHG1可改善这种炎性状态，及其蛋白图；E：LPS诱导下软骨细胞的增殖受到抑制，而SNHG1可解除这种抑制作用。与Control相比，*P<0.05，**P<0.01；与LPS相比，#P<0.05，##P<0.01。图2 SNHG1对LPS诱导下软骨细胞的影响Fig.2 Effect of SNHG1 on LPS-induced chondrocytes

2.3 敲低miR-195-5p可降低软骨细胞中LPS诱导下细胞的高凋亡率并改善炎症微环境

细胞功能试验结果显示，LPS干预下，软骨细胞表现出了较高凋亡率与高水平炎性因子(包括转录与蛋白水平)，较低的细胞增殖水平。通过转染miR-195-5p抑制剂至软骨细胞，实现miR-195-5p表达敲低后，以上结果均向对照组靠近，但离对照组还具有一定程度。以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 miR-195-5p是SNHG1的直接靶目标

我们经过生物信息学分析发现，miR-195-5p与SNHG1存在潜在靶向位点。双荧光素酶报告分析中，miR-195-5p模拟物仅显著调低SNHG1-Wt(而非SNHG1-Mut)。RNA免疫沉淀分析中，含有Ago2的miR-195-5p复合物中高度募集SNHG1。下拉实验中，SNHG1仅被生物素标记的miR-195-5p-WT拉下。此外，我们还发现转染SNHG1过表达序列的软骨细胞中存在较低水平miR-195-5p。以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A：miR-195-5p-SNHG1潜在结合位点；B：双荧光素酶报告；C：RNA免疫沉淀实验；D：RNA下拉实验；E：miR-195-5p-SNHG1关系。与miR-NC/pcDNA3.0相比，**P<0.01，***P<0.001；与LPS相比，###P<0.001。图4 SNHG1、miR-195-5p的表达Fig.4 Expression levels of SNHG1 and miR-195-5p

2.5 SNHG1-miR-195-5p调控轴可在体内改善OA大鼠的凋亡相关因子水平与炎症微环境

对OA大鼠模型注射SNHG1促进剂与miR-195-5p抑制剂进行治疗，结果发现凋亡因子Caspase-3、Bax/Bcl-2的转录与蛋白水平均显著低于模型组，但是仍显著高于对照组。此外，炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α也具有相似结果。以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图5。

3 讨论

OA是较常见的骨关节慢性疾病，影响世界人口15 %以上，最新研究表明，中国现在的膝骨性关节炎患者达1.1亿，这给社会带来了很大的经济负担[19]。目前的研究表明OA与细胞因子、信号通路、基质金属蛋白酶及免疫因素等有关，但具体的发病机制仍不清楚[20]。有研究[21]表明，LncRNA-miRNA集成网络可调控OA进展，对其进行动态监测以及人为干预可能有利于OA病情的逆转。在Lei等[22]的研究中，强化SNHG1表达可通过靶向抑制miR-16-5p并介导p38 MAPK-NF-κB信号通路减轻OA的代谢功能障碍与炎性状态，提示SNHG1在OA的进程中可起缓解作用。又有Shu等[17]的报导中，miR-195-5p在OA中高表达，敲低其表达可通过靶向REGγ降低软骨细胞的凋亡水平与炎性程度，提示开发miR-195-5p抑制剂有助于遏制OA进程。在本研究中，我们发现SNHG1可以改善LPS诱导的软骨细胞代谢异常并降低促炎细胞因子的表达，抑制了OA的发展。发现SNHG1在OA患者软骨组织中下调，而miR-195-5p上调，SNHG1和miR-195-5p的表达呈负相关，两者可能介导了OA的病理过程，这可能成为治疗新靶点。

注：A～B：SNHG1-miR-195-5p调控轴对OA大鼠凋亡相关因子转录与蛋白水平的影响，及其蛋白图；C～D：SNHG1-miR-195-5p调控轴对OA大鼠炎性因子转录与蛋白水平的影响，及其蛋白图。与Control相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model相比，##P<0.01。图5 SNHG1-miR-195-5p调控轴对OA大鼠的影响Fig.5 Effect of SNHG1-miR-195-5p regulatory axis on OA rats

OA治疗药物的抗炎性往往体现于对炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌抑制[23]。我们在软骨细胞中上调了SNHG1的表达，发现高水平SNHG1可显著降低细胞凋亡率，抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌，从而改善软骨细胞炎性微环境，还可恢复细胞的增殖水平。同样我们通过转染miR-195-5p抑制序列到软骨细胞，实现miR-195-5p表达的敲低，可降低软骨细胞中LPS诱导下细胞的高凋亡率并改善炎症微环境。可见开发SNHG1促进剂或miR-195-5p抑制剂有助于通过维护软骨细胞分子微环境，包括调节凋亡、增殖能力与炎性状态等，实现OA病情的改善。我们还发现SNHG1与miR-195-5p存在结合位点，miR-195-5p模拟物可显著调低SNHG1-Wt，含有Ago2的miR-195-5p复合物可募集SNHG1，仅生物素标记的miR-195-5p-Wt被SNHG1下拉。此外，过表达SNHG1还可敲低miR-195-5p水平。综合以上结果，SNHG1作为内源性RNA，可充当miR-195-5p的分子海绵，实现对其表达的负向调控，两者之间存在确切靶向关系。SNHG1可靶控miR-195-5p介导OA软骨细胞的发展，并且主要从软骨细胞凋亡、增殖以及炎性微环境中发挥调控作用。

我们还进行了体内研究，验证了SNHG1促进剂与miR-195-5p抑制剂在OA小鼠中的作用。结果表明，模型组大鼠软骨组织出现了较高水平的Caspase-3、Bax/Bcl-2(转录与蛋白水平)以及较高水平的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α，提示模型组大鼠已表现出了明显的软骨凋亡与炎性微环境等OA进展情况。而当我们对模型组大鼠进行SNHG1促进剂或miR-195-5p抑制剂干预后，以上结果均出现了明显改善，提示SNHG1促进剂或miR-195-5p抑制剂可在转录与蛋白水平上显著抑制模型组大鼠体内的凋亡因子与炎性因子，有助于阻止软骨凋亡并修复炎性微环境。在Hu等[24]的研究中，证实了细胞凋亡因子在OA大鼠体内的影响，下调促凋亡因子Caspase-3、Bax以及上调抗凋亡因子Bcl-2对于抑制软骨细胞凋亡从而发挥保护作用具有重要效力，这也与本研究的结果相吻合。

综上所述，存在SNHG1-miR-195-5p调控网络介导软骨细胞的凋亡与炎性微环境，开发SNHG1促进剂或miR-195-5p抑制剂可能有利于OA的治疗。