甜菜碱比色检测分析条件优化及在枸杞中的应用

◎ 史 蓉，张月蓉，陈丽娟

（酒泉市食品检验检测中心，甘肃 酒泉 735000）

枸杞（Lycium barbarum）是药食同源茄科类植物，具有明目安神、补肾生精、保护视网膜和抗氧化降血脂等功效[12-13]。枸杞果、叶、茎中普遍存在甜菜碱，是植物果实中的主要药用成分之一。目前检测甜菜碱的方法主要有比色法、离子色谱法、液相色谱法，但普遍存在仪器设备昂贵、操作复杂、人员技术要求高等问题。本研究旨在通过优化检测条件，建立一种便于操作的甜菜碱快速检测方法，并应用在枸杞产品中，对企业优选枸杞品种、提取产品有效成分、提高产品品质起到促进作用。

本试验的难点在于甜菜碱和雷氏盐的反应物是沉淀，要尽可能完整的保留沉淀而去除剩余红色试剂，使其不干扰比色反应。在试验了多种过滤方法后，选择0.22 μm的针头滤器滤去多余试剂，再用洗脱液溶解沉淀收集于比色管。整个过程不用更换反应管、损失小、能完整保留沉淀，结果准确。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞（甘肃酒泉市场销售）；甜菜碱标准品（99.2%，中国食品药品检定研究院）；丙酮、盐酸（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；雷氏盐（分析纯，天津光复精细化工研究所）。

1.2 仪器与设备

UV-800S紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SP-756P型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；FE20型酸度、ME203/02型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DFT-100型手提式高速粉碎机（上海精胜科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 甜菜碱标准溶液的制备

精密称取甜菜碱标准品20 mg定容于10 mL容量瓶得标准溶液浓度为2 mg·mL-1。

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1.3.2 甜菜碱的检测方法

注射器式塑料取样管，下端连接夸克阀和0.22 μm的针头滤器，关闭夸克阀，吸取一定量甜菜碱标准溶液注入取样管，加入一定量酸性雷氏盐溶液，冷藏反应一段时间，打开夸克阀，滤除多余雷氏盐试剂，少量冰水淋洗至无红色试剂，加入丙酮溶液溶解甜菜碱雷氏盐沉淀，收集于10 mL比色管，用丙酮溶液定容，在波长525 nm处测定溶液的吸光值。

1.3.3 甜菜碱检测方法的优化

（1）雷氏盐酸性介质。称取1.500 g雷氏盐，加入90 mL蒸馏水，分别用硫酸、盐酸、硝酸3种酸性介质调pH=1.0，超声15 min，过滤，定容于100 mL容量瓶，得酸性饱和雷氏盐溶液。精确吸取2 mg·mL-1甜菜碱标准品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、0.8 mL和1.0 mL，分别滴加雷氏盐溶液5 mL，4 ℃冷藏反应10 min，过滤、淋洗，用70%丙酮洗脱，定容至10 mL容量瓶，使甜菜碱标准溶液浓度为0 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1和0.20 mg·mL-1，525 nm处测吸光度。

（2）丙酮洗脱液浓度选择。标准溶液梯度同（1），分别滴加pH=1.0的雷氏盐溶液5 mL，4 ℃冷藏反应10 min，过滤、淋洗，分别用30%丙酮溶液、50%丙酮溶液、70%丙酮溶液、90%丙酮溶液和100%纯丙酮洗脱沉淀，定容至10 mL容量瓶，525 nm处测吸光度。

（3）反应时间。标准溶液梯度同（1），分别滴加pH=1.0的雷氏盐溶液5 mL，4 ℃冷藏反应10 min、30 min、60 min、120 min和180 min，过滤、淋洗，用70%丙酮溶液洗脱沉淀，定容至10 mL容量瓶，525 nm处测吸光度。

（4）雷氏盐溶液用量选择。为保证雷氏盐与甜菜碱标准溶液反应完全，并微过量。选用的甜菜碱标准溶液浓度为 0.2 mg·mL-1和 0.6 mg·mL-1，分别滴加pH=1.0的雷氏盐溶液1～10 mL，4 ℃冷藏反应10 min，过滤、淋洗，用70%丙酮溶液洗脱沉淀，定容至10 mL容量瓶，525 nm处测吸光度。

1.3.4 枸杞中甜菜碱含量的测定

取7份枸杞样品按照优化后的条件检测。三角瓶精密称取枸杞粉末5.00 g，加纯水220 mL，沸水浴提取1 h，冷却定容至250 mL容量瓶，上清液用硅藻土过滤，吸取待测液1～3 mL，加入盐酸调pH=1.0的饱和雷氏盐5 mL，4 ℃冷藏反应120 min，0.22 μm的滤膜过滤掉反应液，保留沉淀，用70%丙酮溶液溶解洗脱沉淀至10 mL比色管，采用标准曲线测得枸杞样液的吸光度，计算枸杞甜菜碱的含量。

1.4 数据与处理

每组试验平行测定3次，数据为3次的平均值，用Origin 8.0绘制各个试验组的动力学曲线。

2 结果与分析

2.1 甜菜碱检测方法的确定

2.1.1 雷氏盐酸性介质的确定

甜菜碱和雷氏盐需在酸性条件下才能生成沉淀，将饱和雷氏盐溶液用硫酸、盐酸、硝酸调pH=1.0，反应后测得甜菜碱浓度为0.04～0.20 mg·mL-1，硫酸雷氏盐吸光度在0.005～0.069，盐酸雷氏盐吸光度在0.027～0.155，硝酸雷氏盐吸光度在0.018～0.105。可知盐酸雷氏盐溶液吸光度明显高于硫酸雷氏盐和硝酸雷氏盐。这可能是因为硫酸、硝酸为含氧酸，在反应过程中参与了反应，盐酸是无氧酸，性质较稳定，只调节pH，不参与反应，因此选用盐酸为雷氏盐酸度调节剂。

2.1.2 丙酮洗脱液浓度的确定

用5种不同浓度的丙酮溶液洗脱收集测得吸光度。30%丙酮溶液和50%丙酮溶液洗脱后吸光度明显偏低，可能是因为丙酮含量低，洗脱不完全。甜菜碱浓度为0.1 mg·mL-1时，70%丙酮溶液、90%丙酮溶液和100%纯丙酮洗脱后，吸光度分别为0.055、0.065、0.058；甜菜碱浓度为0.2 mg·mL-1时，70%丙酮溶液、90%丙酮溶液和100%纯丙酮洗脱后，吸光度分别为0.145、0.137、0.138，基本无差别。从节约试剂、经济环保的角度考虑，选择70%丙酮溶液为洗脱液。

2.1.3 反应时间的确定

为保证反应完全，甜菜碱溶液需与雷氏盐冷藏反应一段时间，反应180 min后，标准溶液不成线性，反应管壁出现红色析出物，可能是因为雷氏盐不稳定，反应时间过长有结晶析出，影响反应结果。反应120 min后，2个高浓度标液 0.16 mg·mL-1和 0.20 mg·mL-1的吸光值达到最大，为0.129和0.157，说明120 min反应完全，因此选择反应时间120 min。

2.1.4 雷氏盐溶液用量的确定

为保证雷氏盐和甜菜碱充分反应，雷氏盐应微过量，选取甜菜碱标准溶液浓度为0.2 mg·mL-1和0.6 mg·mL-1，分别加入1～10 mL酸性雷氏盐溶液，反应吸光度见图1。0.2 mg·mL-1甜菜碱和5 mL雷氏盐反应吸光值最大，表明加入5 mL雷氏盐即可反应完全，0.6 mg·mL-1甜菜碱和10 mL雷氏盐反应，吸光值仍在上升，说明雷氏盐未达到最大值，因此后续实验中甜菜碱标准溶液最大浓度选用0.2 mg·mL-1，雷氏盐溶液用量5 mL。

图1 不同雷氏盐用量对甜菜碱溶液吸光度的影响图

2.2 标准曲线绘制与枸杞甜菜碱的检测

2.2.1 甜菜碱标准曲线

经试验测定，甜菜碱标准品的吸光度与标准溶液浓度之间的回归方程为A=0.757 1C+0.024 4（A表示吸光度值，C表示溶液浓度），R2=0.999 94，标准曲线见图2。结果表明，甜菜碱含量在0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1和0.20 mg·mL-1与吸光度呈良好的线性关系。

图2 甜菜碱标准曲线图

2.2.2 枸杞甜菜碱的测定

按照1.3.4优化过的方法测得7份枸杞的甜菜碱含量分别为640 mg/100 g、210 mg/100 g、850 mg/100 g、520 mg/100 g、1 100 mg/100 g、1 090 mg/100 g和920 mg/100 g，RSD值在3.2%～7.5%，说明该方法适用性良好。

2.3 精密度试验

精密吸取2 mg·mL-1甜菜碱标液0.2 mL，按照1.3.4优化过的方法测定吸光度，连续测定6次，测得RSD=0.011%，小于2%，表明精密度符合要求。

2.4 回收率试验

精密吸取5份不同浓度的枸杞待测液，分别加入一定量甜菜碱标准溶液，混匀，其余步骤按1.3.4枸杞中甜菜碱的测定方法操作，根据回归方程计算回收率。由表1可知，该方法的回收率为87.5%～110.0%，平均值为95.83%，RSD=9.31%，说明该方法回收率良好。

表1 加标回收率试验结果表

3 结论与讨论

本试验采用比色法检测枸杞中甜菜碱含量，研究了影响试验结果的几个主要因素，最终确定了最佳检测条件，即用盐酸调饱和雷氏盐溶液pH=1.0，在甜菜碱含量0.02～0.20 mg·mL-1，雷氏盐溶液用量5 mL，反应条件为4 ℃冷藏反应120 min，洗脱液为70%丙酮溶液。试验结果表明该方法准确性好、时间短、灵敏度高，样品回收率在87.5%～110%。枸杞提取物中除含有生物碱外，还含有多糖、黄酮、总酚等活性物质，选用雷氏盐法，利用雷氏盐只和生物碱类物质反应的特性，排除了其他干扰物。整个反应过程不更换反应管，利用离心和0.22 μm针式滤膜完整保留反应沉淀，最大程度降低损失，测得枸杞样品的甜菜碱含量为210～1 100 mg/100 g。检测方法方便快捷、准确可信、成本低，适合中小企业枸杞加工企业优选品种、提高枸杞深加工能力，为枸杞产业功能性成分提取开发提供科学依据。