荧光定量PCR 法检测发酵果汁中嗜酸乳杆菌

王虹军，陈芝娟，李晓静

（1. 杭州博日科技股份有限公司，浙江杭州 310053；2. 郑州粮食批发市场有限公司，河南郑州 450000）

0 引言

嗜酸乳杆菌是重要的益生菌之一，也是人体胃肠道中的重要微生物。大数据显示，益生菌被大量应用在食品中尤其是发酵乳制品中[1]。乳酸菌在发酵过程中能合成产生多种芳香物质和功能性成分，赋予发酵食品独特的风味与营养，延长食品的贮藏时间[2-3]，还具有产生抑菌性代谢产物（有机酸、细菌素、过氧化氢等）、平衡肠道微生物生态系统、提高机体免疫力等诸多有利于机体的功能[4-5]。刘鑫等人[6]验证嗜酸乳杆菌发酵上清液可治疗多种肠道致病菌及其L 型菌感染引起的肠道疾病。嗜酸乳杆菌还能通过吸收同化胆固醇有效地降低胆固醇的含量[7]。Tajik H 等人[8]分析了与腐败性细菌作用产生的有机致癌物质有关的细菌酶，经试验验证，嗜酸乳杆菌可以通过降低相关细菌酶的活性来降低它们向致癌物质转变的可能。乳酸菌发酵果汁能在原果汁拥有的营养价值基础上增添乳酸菌的有益功效，能够满足人们对健康和食品功能性的需求，加上果蔬产量的迅猛加增，乳酸菌发酵果蔬汁开始流行，发展前景十分广阔[9]。

随着发酵产品种类和数量的日益加增，发酵物料中乳酸菌的定量检测已成为产品质量与功能评价的一项重要指标。目前，食品中乳酸菌检验方法有平板计数法（GB 4789.3—2016 规定）、流式细胞术、荧光定量PCR 法等，其中荧光定量PCR 技术因其拥有的高重复性、高灵敏度、无污染性等优点，在食品微生物检测中得到了广泛应用[10]。依据嗜酸乳杆菌基因保守区域序列设计出的引物及探针，运用实时荧光定量PCR 方法对果汁中嗜酸乳杆菌进行定量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜酸乳杆菌，中国计量大学生命科技学院食品系提供；嗜酸乳杆菌发酵果汁；TaKaRa 基因组DNA纯化试剂盒，用于提取并纯化目标细菌的DNA。

MRS 培养基：胰蛋白胨10 g，七水合硫酸镁0.58 g，柠檬酸氢二胺2 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.25 g，酵母浸粉5 g，吐温- 80 1 mL，加蒸馏水至1 000 mL 调节pH 值至6.2~6.4，于立式压力蒸汽灭菌器内121 ℃下灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1D 单型人单面垂直净化工作台，苏州智华净化精密仪器有限公司产品；SHP-250 型生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司产品；Lambda 25 型紫外可见分光光度计，美国Perkin Elmer 公司产品；Kendro D-37520 型高速冷冻离心机，德国SorvallHeraeus 公司产品；GelX1650 型凝胶成像仪，上海欧翔科学仪器有限公司产品；QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument（96-well 0.2 mL Block） by Thermo Fisher Scientific。

1.3 试验方法

1.3.1 嗜酸乳杆菌含量与OD600线性关系

以嗜酸乳杆菌培养的最适条件，在液体MRS 培养基中连续活化2 次（菌种为保藏于-20 ℃的菌种），第2 次活化15 h 至其生长对数期。将这时的菌液稀释为不同吸光度（OD600值分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0），相应吸光度的菌液再稀释为适宜的3 个连续浓度，分别进行平板稀释涂布，每个浓度3 个平行，置于培养箱培养36 h 后，选取有效的平板（菌落数在30~300 CFU/mL） 进行菌落计数。

1.3.2 模拟样品及未知样品核酸提取

（1） 模拟和未知样品制备。将嗜酸乳杆菌活化后培养至109CFU/mL，以未发酵果汁为基质，进行梯度稀释，分别为109，108，107，106，105，104，103CFU/mL，备用；将驯化成功的嗜酸乳杆菌按3%的量接入调好糖度、灭过菌的果汁中开始发酵，发酵完成后，取一部分进行平板稀释涂布，计算菌落数，其余备用。

（2） 核酸提取。样品混匀，将上述梯度稀释液和发酵完成的果汁按基因组DNA 纯化试剂盒所配说明进行核酸提取（若提取好的DNA 需较长时间存放则需用Elution Buffer 洗脱，置于-4 ℃或-20 ℃冰箱中，且不能反复冻融）。

1.3.3 核酸凝胶电泳检测核酸

（1） 制胶。0.25 g 琼脂糖+ 25 mL 1×TAE 微波炉加热溶解，不烫手时倒胶。胶成型后，放入电泳槽内，往槽内加入缓冲液（槽内的缓冲液液面需盖过胶面）。

（2） 进样。15 000 DNA Marker 3 μL，DNA 提取物与溴酚蓝染剂按4 μL+1 μL 体系混匀，用移液枪分别移至凝胶的样孔中。

接通电泳仪和电泳槽开始跑样，当溴酚蓝的条带至距胶板前沿约1 cm 处时，停止电泳，将凝胶从槽中取出放入凝胶成像仪的样品室中，进行分析。

1.3.4 引物、探针设计

利用SPIDR 保守区域的序列设计特异性引物、探针，用于嗜酸乳杆菌的鉴定[11]。

1.3.5 荧光定量PCR 的扩增体系

Real-Time PCR 总反应体系是20 μL，包括Ta-KaRa 探测仪混合物10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，探针（5 μmol/L） 0.5 μL，DNA 模板2.0 μL，剩余部分以去离子水补齐。设置Real-Time PCR 反应要素为95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，35 s，40 个循环。

1.3.6 模拟样品检测

将药品按所需加入样孔板中，其中的模板为梯度稀释液中提取出的DNA，利用设置好反应条件的实时荧光定量PCR 仪对模拟样品实施测定，所有浓度各设3 个平行。

1.3.7 未知样品检测

以在发酵果汁中提取出的DNA 为模板，将所需药品按各自规定好的量加入样孔板中，然后利用实时荧光定量PCR 仪以设置好的所有参数对未知样品实施测定，样品设置3 个平行。

2 结果与分析

2.1 嗜酸乳杆菌含量与OD600 值标准曲线

为了实现模拟样品所需菌含量的准确培养，在进行模拟样品制备之前，采用平板计数法将不同吸光度所对应的嗜酸乳杆菌的数量统计出来，并绘制成标准曲线。

嗜酸乳杆菌含量与OD600值的标准曲线见图1。

由图1 可知，曲线的相关系数为R2=0.992 8，所以嗜酸乳杆菌的含量与OD600值之间存在良好的线性关系，可用于后续试验。

图1 嗜酸乳杆菌含量与OD600 值的标准曲线

2.2 核酸电泳结果

将提取出的DNA 进行核酸凝胶电泳，检测核酸的提取是否成功。

凝胶成像图见图2。

图2 凝胶成像图

由图2 可知，8 样泳道有明显条带，6，8 泳道处条带微显，其余样品孔均无明显条带。已知条带的荧光强度与DNA 含量成正比，因此分析原因为其余样品的核酸含量比较低，所以未出现明显条带，但荧光定量PCR 法具有比常规PCR 法高得多的灵敏度，其绝对灵敏度可达到3 pg，所以提取出的核酸可用于后续试验。

2.3 模拟样品检测及标准曲线建立

模拟样品标准曲线见图3。

图3 模拟样品标准曲线

在以未发酵苹果汁为基质的模拟样品的检测中，以模拟样品各梯度浓度所含菌落数的对数值（lg（CFU/mL）） 为横坐标，以运行过程中Ct 值为纵坐标制作标准曲线。由图3 看出，模拟样品这两条件之间有着较好的线性关系，这就证明这个试验方法是行得通的。

2.4 未知样品检测结果

发酵苹果汁的嗜酸乳杆菌中提取出的DNA 经设置好的实时荧光定量PCR 方法分析，检测计算得出嗜酸乳杆菌的含量为2.27×108CFU/mL，最终定量结果与平板计数法所得结果（菌落数=2.32×108CFU/mL） 基本一致。由试验数据可知采用实时荧光定量PCR 方法可以准确有效地定量苹果汁中的嗜酸乳杆菌。

3 结论

用于荧光定量PCR 的DNA 模板有一定的纯度要求，因此要选用适当的方法提取样品中的DNA。果蔬基质中核酸提取的干扰因素相对较少，用试剂盒法（带吸附柱） 提取比较合适[12]，上边试验中目标菌DNA 提取就选用的该法。

对于乳酸菌饮料中活菌的检测，现行的国家标准采用的是平板计数法，该方法最大的缺点是样品检测周期长，难以满足食品行业准确鉴定和快速检测的发展需要。因此，运用基于PCR 的分子学方法尤其是RT-PCR 技术更具实际发展意义。Guo Z H 等人[13-14]通过实时荧光定量方法对发酵物中嗜酸乳杆菌进行定量定性。吴荣荣等人[15]选择实时荧光定量PCR法对发酵乳中的德氏乳杆菌和嗜热链球菌实施定量分析，最终数据显示与平板计数得到的菌的数目基本一致。以上列出的研究都有效表明了实时荧光定量PCR法非常适合于乳酸菌发酵饮品的快速计数，且定量过程相对较快，还可以实现多个样品的同时检测和自动化[16]。其超高灵敏度和良好的重复性在姜鸿瑞等人[17-18]建立的荧光定量分子检测方法中也被充分验证。