无叶假木贼的化学成分及抗菌活性研究

孙 艳，沈庆国，屈玲霞，赵森森，张娜娜，王竣楠，郇旭升，庄华青，张 丽，关永霞*，汪 冶

无叶假木贼的化学成分及抗菌活性研究

孙 艳1, 2，沈庆国1, 2，屈玲霞1, 2，赵森森1, 2，张娜娜1, 2，王竣楠1, 2，郇旭升1, 2，庄华青1, 2，张 丽1, 2，关永霞1, 2*，汪 冶3*

1. 鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006 2. 鲁南制药集团股份有限公司中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006 3. 丽水学院，浙江 丽水 323000

研究无叶假木贼的化学成分及其抗菌活性。采用RP-C18、Sephadex LH-20、硅胶等柱色谱进行分离纯化，根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。采用MTT比色法对化合物进行抗枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌pv.活性筛选。从无叶假木贼中分离了10个化合物，分别鉴定为假木贼碱（1）、-甲基假木贼碱（2）、6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3-ol（3）、2-(2-(pyridine-3-yl) pyridin-5-yl)-6- (pyridin-3-yl)piperidine（4）、2-(pyridine-3-yl)-5-(6-(pyridine-3-yl) pyridine-2-yl) pyridine（5）、白羽扇豆碱（6）、12-甲基金雀花碱（7）、金雀花碱（8）、水杨酸（9）、香草酸（10）。化合物9对番茄疮痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）分别为20.0、10.0、10.0、20.0 µg/mL。化合物3和5为新化合物，分别命名为无叶假木贼碱A和无叶假木贼碱B；化合物6～10为首次从该属植物中分离得到。化合物9具有明显的抗菌活性；从无叶假木贼中分离得到的生物碱类化合物1～8对上述病原微生物抑制作用不明显。

无叶假木贼；生物碱；抗菌活性；无叶假木贼碱A；无叶假木贼碱B；白羽扇豆碱；12-甲基金雀花碱；金雀花碱

无叶假木贼L.为藜科假木贼属植物[1]，又称毒藜、无叶毒藜、阿那培斯、木烟等，半灌木，高20～50 cm。主要分布于我国甘肃西部、新疆，欧洲、中亚以及俄罗斯西伯利亚也有分布，生长于荒漠、戈壁、沙丘及干旱山坡[2]。该植物具有杀虫止痒的功效，可用于治疗疥癣、疥疮和湿疹痒痛；民间主要用于防治菜青虫、蚜虫等多种害虫[3]。目前报道的化学成分主要有生物碱、萜类、皂苷类和生物大分子等[4]，表现出抗胆碱酯酶活性、抗微生物和杀虫等活性[5-6]。

我国对该植物化学成分的研究报道较少，为了明确无叶假木贼药效物质基础，合理开发其药用资源，本实验对无叶假木贼地上部分95%乙醇提取物开展了化学成分研究及抗菌活性研究。从中分离得到10个化合物（图1），分别鉴定为假木贼碱（anabasine，1）、-甲基假木贼碱（-methyl anabasine，2）、6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3-ol（3）、2-(2-(pyridine-3-yl) pyridin-5-yl)-6-(pyridin-3- yl)piperidine（4）、2-(pyridine-3-yl)-5-(6-(pyridine-3- yl)pyridine-2-yl)pyridine（5）、白羽扇豆碱（lupanine，6）、12-甲基金雀花碱（12-methylcytisine，7）、金雀花碱（cytisine，8）、水杨酸（2-hydroxybenzoic acid，9）、香草酸（vanillic acid，10）。其中化合物3和5为新化合物；化合物6～10为首次从该属植物中分离得到。化合物9具有明显的抗菌活性，对番茄疮痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌pv.的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）为20.0、10.0、10.0、20.0 µg/mL。化合物10具有一定的抗细菌活性，对溶血葡萄球菌和根癌土壤杆菌的MIC均为50.0 µg/mL。从无叶假木贼中分离得到的生物碱类化合物1～8对上述病原微生物抑制作用不明显。

图1 化合物1～10的结构

1 仪器与材料

INOVA-400核磁共振仪（Varian公司，美国）；HP-5973型质谱仪、HP1100MSD（ESI）型质谱仪（Agilent公司，美国）；Waters 2489型液相色谱仪（Waters公司，美国），半制备用色谱柱为SunFireTM-C18（Waters，150 mm×10 mm，10 μm）柱和Kromasil-C18（Kromasil，250 mm×10 mm，5 μm）柱；Rotavapor R-220旋转蒸发仪（Büchi公司，瑞士）；柱色谱材料：粗硅胶40～80目、柱色谱硅胶200～300目、薄层色谱硅胶H（60型）、薄层色谱硅胶GF254及预制硅胶板GF254（青岛海洋化工有限公司）；反相色谱硅胶（RP-C18，德国Merck公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（Amersham Pharmacia Biotech公司）。

药材采自新疆石河子，由新疆石河子大学生命科学学院闫平教授鉴定为无叶假木贼L. 地上部分，样本（000156）存放于贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室。抗菌活性所用菌种由中国农业大学植物病理学系提供。

2 提取与分离

干燥的无叶假木贼地上部分（13.0 kg），用8倍量95%乙醇加热提取3次，每次3 h，合并提取液。减压浓缩提取液至无醇味，得到乙醇粗提物，用蒸馏水加热溶解制成水悬液。首先，用10%的盐酸调节pH值至3.0左右，醋酸乙酯萃取，浓缩后得到醋酸乙酯组分（116.0 g）；剩余的水溶液，用10%的氨水调节pH值至9.0左右，氯仿萃取次，减压浓缩萃取液，得到氯仿部分（生物碱组分118.5 g）和水部分[7]。

氯仿部位加适量甲醇和氯仿溶解，经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝胶柱色谱, 得到生物总碱。生物总碱部分经硅胶柱色谱，石油醚-二乙胺梯度洗脱（6∶1～1∶1），通过TLC检测合并相似组分后得到6个部分（Fr. 1～6）。Fr. 1经过Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝胶柱色谱和反相硅胶（RP-C18）柱色谱分离纯化，分别得到化合物2（239.0 mg）和4（62.0 mg）。Fr. 2经硅胶柱色谱以石油醚-二乙胺（5∶1～4∶1）洗脱，再经过Sephadex LH-20（甲醇）凝胶柱色谱，得到化合物3（39.0 mg）、7（20.0 mg）和8（15.0 mg）。Fr. 3经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝胶柱色谱、反相硅胶（RP-18）柱色谱（甲醇-水60∶40）和半制备型高效液相色谱仪（pre-HPLC，甲醇-水70∶30，ODS柱）分离纯化，得到化合物6（18.0 mg）。其中Fr. 4经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝胶柱色谱、正相硅胶（硅胶300～400目）柱色谱 [石油醚-二乙胺（3∶1～2∶1）]，得到化合物1（32.0 mg）和5（14.0 mg）。

醋酸乙酯部位氯仿溶解后经用石油醚、石油醚-醋酸乙酯（80∶1～1∶1）梯度洗脱，通过TLC检测合并相似组分后得到4个部分（Fr. 7～10），Fr. 7经硅胶常压柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（60∶1～10∶1）梯度洗脱，洗脱液采用薄层色谱检测，合并相同组分，进一步分离，经Sephadex LH-20凝胶柱（氯仿-甲醇1∶1）色谱纯化，得到化合物9（20.0 mg）和10（19.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：黄色油状物；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点，ESI-MS/: 163 [M＋H]+；C10H14N2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.63 (1H, s, H-2′), 8.49 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6′), 7.85 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′), 7.26 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5′), 5.85 (1H, -NH, brs), 3.80 (1H, dd,= 3.2, 11.2 Hz, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 148.8 (C-2′), 148.7 (C-6′), 137.6 (C-3′), 134.7 (C-4′), 123.5 (C-5′), 58.9 (C-2), 46.5 (C-6), 32.7 (C-3), 24.2 (C-5), 23.9 (C-4). 以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定化合物1为假木贼碱。

化合物2：黄色油状物；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点，ESI-MS/: 177 [M＋H]+；C11H16N2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.58 (1H, s, H-2′), 8.48 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6′), 7.72 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′), 7.25 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5′), 2.18 (3H, s, -CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 148.5 (C-2′), 148.4 (C-6′), 140.6 (C-3′), 134.1 (C-4′), 123.4 (C-5′), 59.7 (C-2), 47.5 (C-6), 34.7 (C-3), 29.2 (-CH3), 25.6 (C-5), 25.1 (C-4)。以上数据与文献报道基本一致[9-10]，故鉴定化合物2为-甲基假木贼碱。

化合物3：黄色油状物；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点，推断为生物碱类化合物。EI-MS: 243 (M+，80), 228 (90), 214 (100), 200 (93)；ESI-MS: 244 [M＋H]+，266 [M＋Na]+；表明该化合物的相对分子质量为243，提示含有奇数个氮原子。

1H-NMR (400 MHz, DMSO-6) 低场区H9.24 (2H, s), 8.46 (1H, d,= 4.8 Hz), 8.40 (1H, d,= 8.0 Hz), 7.42 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz) 提示有ABX偶合系统；H7.20 (1H, d,= 8.4 Hz), 6.55 (1H, d,= 8.4 Hz) 提示有相邻芳香质子；在高场区H3.45 (4H, q,= 7.2 Hz), 1.10 (6H, t,= 7.2 Hz) 提示有对称乙基结构片段。13C-NMR (100 MHz, DMSO-6) 低场区有10个碳原子信号，分别是C151.0 (s), 149.5 (d), 147.8 (d), 142.8 (s), 136.9 (s), 135.5 (d), 134.4 (s), 127.9 (d), 123.0 (d), 106.8 (d)，在高场区有2个碳信号C42.1 (t), 13.1 (q)。结合质谱、氢谱和碳谱数据分析可推测该化合物的分子式为C14H17N3O，不饱和度Ω＝8，提示含有2个吡啶结构单元，从H3.45 (4H, q,= 7.2 Hz), 1.10 (6H, t,= 7.2 Hz) 和C42.1 (t), 13.1 (q) 可以推测含有-(CH2CH3)2结构单元。还有1个羟基化学位移在H9.24与吡啶单元质子信号重叠。

2个吡啶单元取代情况需要借助二维谱解析。从HMBC谱可以看出H3.45 (H-1″) 与C151.0 (C-6) 相关，H7.20 (H-4) 与C151.0 (C-6), 136.9 (C-2),142.8 (C-3) 相关。H6.55 (H-5) 与C142.8 (C-3) 相关，羟基质子H9.24与C142.8 (C-3) 和C136.9 (C-2) 相关。从以上-(CH2CH3)2和羟基在同一个吡啶结构单元中并确定它们的取代位置。通过H7.42 (H-5′) 分别与C147.8 (C-6′), 135.5 (C-4′), 134.4 (C-3′) 相关，8.40 (H-4′) 与136.9 (C-2) 相关，H9.24 (H-2′) 分别与134.4 (C-3′), 136.9 (C-2) 相关可以确定另一个吡啶结构单元取代位置，由此确定2个吡啶结构单元的连接方式。因此确定化合物3的结构为6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3-ol，其结构和HMBC主要相关见图2。通过数据库检索，确定化合物3是新化合物，命名为无叶假木贼碱A。氢谱和碳谱数据详细归属见表1。

图2 化合物3的结构和HMBC图谱

表1 化合物3的氢谱(400 MHz, DMSO-d6) 和碳谱(100 MHz, DMSO-d6) 数据

Table 1 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) and 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) data of compound 3

碳位δCδHDEPT碳位δCδHDEPT 1 2′149.59.24 (1H, s)CH 2136.9 C3′134.4 C 3142.8 C4′135.58.40 (1H, d, J = 8.0 Hz)CH 4127.97.20 (1H, d, J = 8.4 Hz)CH5′123.07.42 (1H, dd, J = 8.0, 4.8 Hz)CH 5106.86.55 (1H, d , J = 8.4 Hz)CH6′147.88.46 (1H, d, J = 4.8 Hz)CH 6151.0 C1″42.13.45 (4H, q, J = 7.2 Hz)CH2 1′ 2″13.11.10 (6H, t, J = 7.2 Hz)CH3

化合物4：黄色油状物；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点，ESI-MS/: 317 [M＋H]+；C20H20N4，1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.17 (1H, s, H-2"), 8.75 (1H, s, H-6′), 8.66 (1H, s, H-2′′′), 8.63 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6"), 8.50 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6′′′), 8.31 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′′), 7.95 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′), 7.83 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′′′), 7.30 (1H, d,= 8.0 Hz, H-3′), 7.40 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5), 7.28 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5′′′), 3.94 (1H, d,= 10.2 Hz, H-2), 3.90 (1H, d,= 10.2 Hz, H-6), 2.03 (1H, m, Ha-4), 1.69 (1H, m, He-4), 1.84 (2H, m, Ha-3, 5), 1.60 (2H, m, He-3, 5)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 153.7 (C-2′), 149.7 (C-6′′), 148.9 (C-6′), 148.7 (C-6′′′), 148.6 (C-2′′′), 148.0 (C-2), 140.4 (C-3′′′), 139.8 (C-5′), 135.4 (C-4′), 134.7 (C-3), 134.4 (C-4′′′), 134.2 (C-4), 123.5 (C-5), 123.4 (C-5′′′), 120.4 (C-3′), 59.9 (C-6), 59.6 (C-2), 34.4 (C-3, 5), 25.3 (C-4)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物4为2-(2-(pyridin-3-yl) pyridin-5-yl)- 6-(pyridin-3-yl) piperidine。

化合物5：淡黄色油状物；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点，推断可能为生物碱类化合物。EI-MS: 310 (M+，100)；ESI-MS: 311 [M＋H]+；表明该化合物的相对分子质量为310；1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 显示质子信号全部位于低场区，其中H9.44, 9.35, 9.29提示含有3个吡啶结构单元，1H-1H COSY谱显示，H-2′′/H-6′′/H-4′′，H-2′′′/H-6′′′/H-4′′′，H-3/H-4/H-5存在相关。提示含有2个3-取代吡啶结构单元，分别是H9.35 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′′), 8.69 (1H, t,= 8.0, 3.6 Hz, H-6′′), 8.42 (1H, dd,= 8.0, 3.6 Hz, H-4′′), 7.46 (1H, t,= 8.0 Hz, H-5′′) 和H9.29 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2′′′), 8.69 (1H, t,= 8.0, 3.6 Hz, H-6′′′), 8.49 (1H, dd,= 8.0, 4.0 Hz, H-4′′′), 7.46 (1H, t,= 8.0 Hz, H-5′′′)。还有1个2,5-二取代吡啶结构单元H9.44 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6′), 8.59 (1H, dd,= 2.0, 8.4 Hz, H-4′), 7.92 (1H, d,= 8.4 Hz, H-3′)。另外从H7.94 (1H, t,= 8.0 Hz, H-4), 7.84 (1H, d,= 8.0 Hz, H-3), 7.80 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5) 可知还有1个2,6-二取代吡啶结构单元。13C-NMR谱给出20个碳信号峰，结合DEPT谱将它们归属为14个叔碳和6个季碳，结合质谱和氢谱分析可推断其分子式为C20H14N4，不饱和度为16，因此结构中有4个吡啶环。13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 数据显示骨架与化合物4相似，在低场区比化合物4多出1个吡啶结构单元，在高场区没有出现哌啶环结构信息。

从HMBC图谱（图3）可以观察到H9.29 (H-2′′′), 8.49 (H-4′′′) 分别与C154.6 (C-6) 相关，H9.44 (H-6′), 8.59 (H-4′), 8.42 (H-4′′) 分别与C154.8 (C-2′) 相关，H7.92 (H-3′) 与C134.3 (C-3′′) 相关，H7.84 (H-3) 分别与C133.4 (C-5′), 154.1 (C-2) 相关。从而确定4个吡啶环连接顺序，通过HMQC谱将C和H的关系进行了归属。由此将化合物5的结构确定为6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3- ol，通过数据库检索，确定化合物5为新化合物，命名为无叶假木贼碱B，1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 和13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 数据见表2。

图3 化合物5结构和1H-1H COSY、HMBC图谱

表2 化合物5的氢谱和碳谱数据(400/100 MHz, CDCl3)

Table 2 1H-NMRand 13C-NMR data of compound 5(400/100 MHz, CDCl3)

碳位δCδHDEPT碳位δCδHDEPT 1 1′′ 2133.4 C2′′148.39.35 (1H, d, J = 2.0 Hz)CH 3119.47.84 (1H, d, J = 8.0 Hz)CH3′′134.3 C 4138.17.94 (1H, t, J = 8.0 Hz)CH4′′134.48.42 (1H,dd, J = 8.0, 3.6 Hz)CH 5119.47.80 (1H, d, J = 8.0 Hz)CH5′′123.67.46 (1H,t, J = 8.0 Hz)CH 6154.6 C6′′150.18.69 (1H, dd, J = 8.0, 3.6 Hz)CH 1′ 1′′′ 2′154.8 C2′′′148.39.29 (1H, d, J = 1.6 Hz)CH 3′120.47.92 (1H, d, J = 8.4 Hz)CH3′′′134.3 C 4′135.38.59 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz)CH4′′′134.48.49 (1H, dd, J = 8.0, 4.0 Hz)CH 5′133.4 C5′′′123.67.46 (1H, t, J = 8.0 Hz)CH 6′148.59.44 (1H, d, J = 2.0 Hz)CH6′′′150.18.69 (1H, dd, J = 8.0, 3.6 Hz)CH

化合物6：无色油状物；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点；ESI-MS/: 249 [M]+；分子式C15H24N2O。1H-NMR (400 MHZ, CDCl3): 1.80 (2H, m, H-3), 1.84 (2H, m, H-4), 2.01 (2H, m, H-7), 1.48 (1H, m, H-8α), 1.78 (1H, d,= 12.0 Hz, H-8β), 1.77 (1H, m, H-9), 2.29 (1H, m, H-10β), 4.61 (1H, m, H-10α), 2.11 (1H, m, H-11), 1.78 (1H, d,= 12.0 Hz, H-13β), 1.39 (1H, m, H-13α), 4.48 (1H, m, H-14), 2.77 (1H, d,= 8.0 Hz, H-15β), 1.80 (1H, m, H-15α), 2.58 (1H, d,= 8.0 Hz, H-17β), 1.83 (1H, m, H-17α)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 169.4 (C-2), 65.6 (C-11), 60.1 (C-6), 54.5 (C-15), 51.5 (C-17), 46.6 (C-10), 37.6 (C-9), 34.5 (C-7), 34.0 (C-3), 32.5 (C-12), 29.1 (C-5), 28.9 (C-8), 22.3 (C-4), 23.3 (C-14), 23.0 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[8,13]，故鉴定化合物6为白羽扇豆碱。

化合物7：无色油状物；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点；ESI-MS/: 205 [M＋H]+；C12H16ON2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.28 (1H, m, H-4), 6.32 (1H, d,= 7.0 Hz, H-3), 6.07 (1H, dd,= 6.7, 1.2 Hz, H-5), 3.88 (1H, d,=12.2 Hz, H-10eq), 3.72 (1H, d,= 12.1 Hz, H-10ax), 3.00～3.18 (4H, m, H-11, 13), 2.90 (1H, m, H-7), 2.04 (3H, s,-CH3), 1.79 (2H, m, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 162.1 (C-2), 151.1 (C-6), 138.8 (C-4), 115.7 (C-3), 103.4 (C-5), 59.6 (C-13), 58.2 (C-11), 49.4 (C-10), 45.6 (C-14), 35.5 (C-7), 27.6 (C-9), 25.4 (C-8)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物7为12-甲基金雀花碱。

化合物8：白色针状晶体（丙酮）；改良碘化铋钾溶液喷雾显色呈红色斑点；mp 154～155 ℃；ESI-MS/: 191 [M＋H]+；C11H14N2O。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.31 (1H, dd,= 9.0, 6.7 Hz, H-4), 6.45 (1H, d,= 9.0 Hz, H-3), 5.95 (1H, dd,= 6.7, 1.2 Hz, H-5), 4.08 (1H, d,=15.6 Hz, H-10eq), 3.88 (1H, dd,= 15.6, 6.6 Hz, H-10ax), 2.85～3.14 (5H, m, H-11, 13, 7), 2.34 (1H, m, H-9), 1.90 (2H, m, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 164.3 (C-2), 150.1 (C-6), 138.8 (C-4), 116.7 (C-3), 103.0 (C-5), 54.0 (C-13), 53.0 (C-11), 49.9 (C-10), 35.7 (C-7), 28.6 (C-9), 26.4 (C-8)。以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定化合物8为金雀花碱。

化合物9：白色粉末；ESI-MS/: 139 [M＋H]+；C7H6O3。1H NMR (400 MHz, CD3COCD3): 7.87 (1H, m, H-6), 7.52 (1H, m, H-4), 6.93 (2H, m, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3): 113.1 (C-1), 162.9 (C-2), 118.0 (C-3), 136.7 (C-4), 119.9 (C-5), 131.2 (C-6), 172.7 (C-7)。以上数据与文献报道一致[15-16]，故鉴定化合物9为水杨酸。

化合物10：白色粉末；ESI-MS/: 169 [M＋H]+；C8H8O4；1H NMR (400 MHz, CD3OD): 7.89 (1H, s, H-6), 7.54 (1H, s, H-2), 6.83 (1H, d,= 8.8 Hz, H-5), 3.88 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.1 (s, COOH), 113.7 (s, C-1), 115.8 (d, C-2), 148.6 (s, C-3), 152.6 (s, C-4), 123.1 (d, C-5), 125.3 (d, C-6), 56.3 (q, OCH3)。以上数据与文献报道一致[17]，故鉴定化合物10为香草酸。

4 抗菌活性筛选

本实验采用MTT比色法（MTT colorimetric assay method）对化合物1～10进行抗5种菌株（枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌pv.）活性筛选，具体步骤如下：将供试菌种接种到LB固体培养基上，培养24 h。接种于25 mL LB液体培养基中，25 ℃摇培。用无菌水把生长后的菌液校正浓度至0.5麦氏比浊标准（×108CFU/mL），再用LB液体培养基1∶100稀释，将菌液稀释到×106CFU/mL。将90 μL×106CFU/mL的菌液加到96孔培养板中；再分别加入10 μL的测试样品液，分别设空白对照（水）组、溶剂对照组、阳性对照（硫酸链霉素）组、加药组。每组设4次重复；培养板四周用封口膜封好，培养24 h；每孔中加入5 mg/mL 10 μL MTT溶液，共培养4 h后，在96孔培养板中无蓝紫色物质生成的药剂最低浓度即为MIC，结果见表3。

实验结果表明，化合物9具有较强的抗菌活性，对番茄疮痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌的MIC为20.0、10.0、10.0、20.0 µg/mL；化合物10对以上4种靶标细菌的MIC分别为100.0、50.0、50.0、100.0 µg/mL；从无叶假木贼中分离得到的生物碱类化合物1～8未对上述5种植物病原微生物表现出明显的抑制活性。

5 讨论

本实验研究了无叶假木贼的化学成分及其抗菌活性，采用现代色谱技术手段分离鉴定了10个化合物，其中化合物1～5哌啶类生物碱，6～8为喹诺里西啶类生物碱，9～10为苯甲酸类衍生物。化合物3和5为新化合物，化合物6～10为首次从该属植物中分离得到。

表3 化合物1～10对细菌的最低抑制浓度

Table 3 Minimal inhibitory concentration (MIC) of compounds 1—10 on bacteria growth

化合物MIC/(µg·mL−1)B. subtilisX. vesicatoriaS. haemolyticusA. tumefaciensP. syringae pv.lachrymans 1100.0100.0100.0100.0100.0 2100.0100.0200.0100.0100.0 3100.0100.0200.0100.0100.0 4100.0100.0100.0100.0100.0 5100.0100.0100.0100.0100.0 6100.0100.0200.0100.0100.0 7100.0100.0100.0100.0100.0 8100.0100.0100.0100.0100.0 950.020.010.010.020.0 10100.0100.050.050.0100.0 硫酸链霉素5.05.01.02.01.5

对分离得到的10个化合物进行抗菌活性筛选，研究结果表明化合物9对番茄疮痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌表现出比较明显的抗细菌活性；其他化合物对上述5种植物病原微生物没有表现出明显的抑制活性。本实验进一步研究了无叶假木贼的化学成分，不仅为其物质基础研究提供了依据，同时在一定程度上丰富了无叶假木贼化合物药理活性的研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Chemical constituents fromand their antibacterial activities

SUN Yan1, 2, SHEN Qing-guo1, 2, Qu Ling-xia1, 2, ZHAO Sen-sen1, 2, ZHANG Na-na1, 2, WANG Jun-nan1, 2, HUAN Xu-sheng1, 2, ZHUANG Hua-qing1, 2, ZHANG Li1, 2, GUAN Yong-xia1, 2, WANG Ye3

1. Lunan Hope Pharmaceutical Co., Ltd.,Linyi 276006, China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Traditional Chinese Medicine of Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 3. Lishui University,Lishui 323000, China

To study the chemical constituents ofand their antibacterial activitiesChromatographic methods were used for the isolation and purification of chemical constituents, and the structures of the isolated compounds were elucidated by spectroscopic analyses and spectroscopic data. And the antimicrobial activities of compounds against,,,,pv.were evaluated by MTT assay.Ten compounds were isolated, and their structures were identified as anabasine (1),-methyl anabasine (2), 6-(diethylamino)-[2,3′–bipyridin]-3-ol (3), 2-(2-(pyridin-3-yl)pyridin-5-yl)-6-(pyridine-3-yl) piperidine (4), 2-(pyridine-3-yl)-5- (6-(pyridine-3-yl)pyridine-2-yl) pyridine (5), lupanine (6), 12-methylcytisine (7), cytisine (8), 2-hydroxybenzoic acid (9), vanillic acid (10). The minimal inhibitory concentration (MIC) of compound 9 against,,andby MTT assay were 20.0, 10.0, 10.0 and 20.0 µg/mL, respectively.Compounds 3 and 5 are two new compounds, named as anabasis aphylla A andanabasis aphylla B, respectively. Compounds 6—10 are isolated from the plants of this genus for the first time. Compound 9 was observed to exhibited good antibacterial activities. The alkaloid compounds 1—8 isolated fromhad no obvious inhibitory effect on the above pathogenic microorganisms.

L; alkaloid; antibacterial activity;anabasis aphylla A; anabasis aphylla B; lupanine; 12-methylcytisine; cytisine

R284.1

A

0253 - 2670(2022)08 - 2278 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.003

2021-09-27

山东省重点研发计划（重大科技创新工程）项目（2020CXGC010505）

孙 艳（1984—），硕士研究生，研究方向为中药新药研发与工艺优化。Tel: 15069956136 E-mail: 253341135@qq.com

汪 冶，研究员，研究方向为药用生物资源开发与利用。Tel: 15157810683 E-mail: 33301816@qq.com

关永霞，硕士研究生，研究方向为中药新药开发与制药共性技术研究。Tel: (0539)8336639 E-mail: jmsgyx@163.com

[责任编辑 王文倩]