牦牛乳与豆乳比例、益生菌和浓缩果汁种类对发酵饮料品质的影响

张玉双,代安娜,2,丁功涛,2,罗丽,王宝民,刘红娜,2*,丁波*

1(西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州,730030) 2(生物医学研究中心中国-马来西亚国家联合实验室(西北民族大学),甘肃 兰州,730030) 3(甘南牦牛乳研究院,甘肃 兰州,730000)4(甘肃绿能农业科技股份有限公司,甘肃 武威,733000)

牦牛乳富含脂肪(5.5%～7.5%)、蛋白质(4.0%～5.9%)和乳糖(4.0%～5.9%)[1],但产量少,受季节性限制,每个泌乳期每头牦牛产乳150～500 kg,仅为传统奶牛产奶量的1/10[2],极大限制了牦牛乳产业的发展。

我国大豆产量丰富,大豆含有30%～45%的蛋白质及人体所需必需氨基酸[3],丰富的不饱和脂肪酸、膳食纤维、矿物质和维生素等,具有降血脂、降胆固醇、预防心血管疾病等功效[4-5]。但豆乳的豆腥味及棉子糖、水苏糖等胀气因子[6]难以被消费者接受。通过益生菌发酵可改善豆乳的风味和口感,有助于改善肠道微生物平衡,同时能降低豆乳低聚糖含量,提高游离异黄酮水平[7]。嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌具有抗菌、抗癌、降低胆固醇和缓解乳糖不耐症等健康益处[8-9],因此研究选用嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌为益生菌菌株。

目前国内外的研究主要集中在益生菌发酵饮料的工艺优化以及产品研发方面[10-11]，研究表明菌株选择是获得足够酸化率的一个重要因素。且使用菌株混合培养可以减少发酵时间和令人不愉快的味道，然而，关于益生菌与发酵剂混合在不同的牦牛乳和豆乳组合中的情况未见报道。本文以牦牛乳和豆乳为原料,分别选取嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌为益生菌,添加浓缩果汁制备新型发酵饮料,旨在确定发酵结束时牦牛乳与豆乳的比例和益生菌种类对发酵饮料理化、微生物和感官特性的综合影响,并分析4 ℃冷藏期间浓缩果汁对发酵饮料活菌数和感官属性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛乳,甘肃华羚;黄豆,黑龙江阳光种业有限公司;浓缩果汁(草莓、梨、桃、蓝莓；固形物含量分别为52、65、60、42°Brix),福建绿泉食品有限公司；商品混合发酵剂YF-L922 (保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)、益生菌(嗜酸乳杆菌LA-5、副干酪乳杆菌LC-01),科汉森(中国)；乳酸、乙酸标准品，上海北诺生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JA2003N型电子天平、TG16-WS型高速离心机、DHG—9241A型恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;PHS-3C型pH计,北京科伟仪器有限公司;LC-20A Prominence液相色谱仪,日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 豆乳的制备[12]

选用粒籽饱满、光滑圆整的黄豆,豆水比1∶3(g∶mL)于20 ℃浸泡10 h。用大豆干重7倍水磨浆,过滤备用。

1.3.2 发酵饮料的制备

分别以100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100的质量比混合脱脂牦牛乳与豆乳,85 ℃杀菌30 min,冷却至40 ℃用发酵剂YF-L922分别与益生菌LA-5、LC-01组合接种混合脱脂牦牛乳与豆乳(发酵剂、益生菌各接种0.01%)。(40±0.2)℃恒温发酵,pH至4.6±0.02时发酵结束,将产品冷却至4 ℃。选取益生菌活菌数最高及感官品质最佳的产品,分别添加草莓、梨、桃、蓝莓浓缩果汁(添加量均为12%)、糖(添加量6%),添加完成后将所得4种产品进行21 d冷藏。

1.3.3 pH和滴定酸度的测定

pH值采用pH计测定。可滴定酸度参照GB 5009.239—2016 《食品安全国家标准 食品酸度的测定》的方法进行测定。

1.3.4 乳酸、乙酸含量的测定

精确称取乳酸、乙酸标准品,用水稀释并定容至100 mL制成混合标准储备液,4 ℃保存。将混合标准储备液用水逐级稀释成20、40、60、80、100 mg/L系列混合标准工作溶液,0.45 μm膜过滤[13]。将5.0 g样品用0.05 mol/L H2SO4稀释至20 mL,均质,3 000 r/min离心15 min,取上清液经0.45 μm膜过滤后分析。条件：色谱柱C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流速1 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL;波长254 nm;检测器：紫外检测器(UV-detector);流动相0.05 mol/L H2SO4。

1.3.5 活菌数测定

采用MRS培养基稀释平板活菌计数法测定。

1.3.6 感官评定

选取发酵饮料第0和第21天贮藏期,由7名训练有素的评审员进行感官分析。取20 mL样品于白色塑料杯中,温度4 ℃。采用评分法进行比较。感官参数为风味、口感和外观。以5分制评分,0=不可饮用,1=不可接受,2=可接受,3=满意,4=优秀。每个感官参数加权计算,风味权重6,口感权重3.5,外观权重2[14]。

1.3.7 数据分析

每组试验重复3次,数据统计采用SPSS 17.0软件进行ANOVA单因素方差分析,并采用Duncan法检验数据的差异显著性(P<0.05,差异显著),制图软件采用Origin 2017。

2 结果与分析

2.1 不同处理对发酵饮料pH、滴定酸度及乳酸、乙酸含量的影响

pH值和滴定酸度是评价发酵饮料品质的重要指标[15]。由表1可知,牦牛乳与豆乳比例对产品的最终滴定酸度有显著影响(P<0.05),牦牛乳比例越高,滴定酸度越大。

表1 不同处理对发酵饮料pH、滴定酸度及乳酸和乙酸含量的影响Table 1 Effect of different treatments on pH, titerable acid, content of lactic acid and acetic acid

图1 发酵过程中不同处理pH值及酸度变化Fig.1 Changes in pH and acidity of different treatments during fermentation

牦牛乳和豆乳的质量比为75∶25和50∶50处理组的pH平均下降速率和酸度上升速率最大(P<0.05),发酵时间最短(图1)。发酵初始时,100∶0处理组的pH降低速率及酸度增加速率较慢,可能是因为牦牛乳酸化后产生的大量无机盐离子与H+结合增强了产品的缓冲能力[16]。0∶100处理组pH下降速率和酸度增加速率明显减慢,是因为豆乳较高含量的固形物使形成酸凝胶的速度减慢,与LEE等[17]研究结果一致。因此牦牛乳中加入豆乳能在一定程度上丰富发酵饮料的营养,但豆乳比例过高会导致发酵底物中干物质比例减少,微生物可利用的底物缺乏。

乳酸和乙酸的含量可以赋予发酵饮料清爽口感[18]。发酵饮料的最终酸度、乳酸和乙酸含量随豆乳比例的增加而下降。这可能与豆乳中含有低聚糖、棉子糖和水苏糖等,pH下降显著,乳酸菌的生长受到抑制有关[19]。100∶0和75∶25牦牛乳处理中乳酸和乙酸含量较高,是因为牦牛乳中的一些嗜酸菌在较低pH下仍能继续代谢产生有机酸通过丙酮酸代谢产生乙酸[19]。如表1所示,以副干酪乳杆菌为益生菌,100∶0、75∶25、50∶50处理组发酵饮料的平均酸度增加速率明显大于嗜酸乳杆菌发酵饮料(P<0.05);当牦牛乳添加量<50%时,含嗜酸乳杆菌处理的平均酸度增加速率更大,说明副干酪乳杆菌的生长更依赖于牦牛乳中的营养物质。

2.2 不同处理对发酵饮料活菌数的影响

益生菌活菌数对发酵饮料的感官品质有较大影响[20]。由表2可知,产品发酵结束后,不同处理的副干酪乳杆菌活菌数均显著高于嗜酸乳杆菌活菌数(P<0.05),这是因为副干酪乳杆菌所具有的良好蛋白酶活性,有助于菌体生长和存活[21]。m(牦牛乳)∶m(豆乳)为75∶25和50∶50时,益生菌活菌数较高,这可能是因为牦牛乳中富含低聚糖、游离氨基酸和多肽等益生菌所需的营养物质[22]。过量的豆乳25∶75、0∶100处理组活菌数较低,可能是由于发酵过程中缺乏益生菌发酵的乳糖或其他生长因子。以嗜酸乳杆菌为益生菌的100∶0处理组活菌数最低(P<0.05),这可能是因为牦牛乳含量过高,导致保加利亚乳杆菌抑制益生菌的过度酸化形成H2O2和细菌素[23]。在益生菌为副干酪乳杆菌 50∶50处理中,益生菌活菌数最高(P<0.05),说明均衡的牦牛乳、豆乳比例对维持发酵饮料中的益生菌活菌数有促进作用。

表2 发酵结束后的活菌数Table 2 Number of probiotics after fermentation

2.3 不同处理对发酵饮料感官品质的影响

感官属性是评价发酵饮料感官品质的重要指标之一[20]。由表3可知,以嗜酸乳杆菌为益生菌的100∶0处理组风味得分最高(P<0.05),以嗜酸乳杆菌为益生菌的100∶0及75∶25处理组外观得分最高(P<0.05),而益生菌为嗜酸乳杆菌的0∶100处理组感官评分最低(P<0.05)。豆乳添加量对发酵饮料的感官属性有显著影响(P<0.05)。豆乳含量过高时,发酵饮料的感官评分较低,这是因为豆乳中缺乏乙醛、双乙酰等重要的乳制品风味物质[24];且豆乳中存在芳香化合物2-异丙基-3-甲氧基吡嗪,会产生令人不愉快的豆腥味[25]。嗜酸乳杆菌在牦牛乳比例较高(100∶0、75∶25)时感官可接受性更好,这可能是嗜酸乳杆菌在牦牛乳中产生乙醛和双乙酰的能力更强导致的[24]。除对照组外,75∶25、50∶50处理组的样品感官评分最高(P<0.05)。由表2可知,以副干酪乳杆菌为益生菌的50∶50处理组活菌数最高(P<0.05)。综合发酵饮料的活菌数和感官评定结果,最终以益生菌为副干酪乳杆菌的50∶50处理组为最佳处理,加入4种浓缩果汁(草莓、梨、桃、蓝莓)贮存21 d。

表3 发酵结束后的感官评定结果Table 3 Sensory evaluation results after fermentation

2.4 浓缩果汁对发酵饮料pH、滴定酸度的影响

如图2所示,冷藏期间发酵饮料pH由4.60降至4.30附近,滴定酸度由48 °T升至51 °T,可能是因为冷藏过程中乳酸菌持续发酵导致发酵饮料酸度上升[21-23]。冷藏21 d后,添加桃浓缩汁处理组的pH最高,最终酸度最低;添加蓝莓浓缩汁的处理组pH最低,最终酸度最高。综上所述,发酵饮料中添加的浓缩果汁类型对产品发酵效果存在影响。

a-pH;b-可滴定酸度S-草莓浓缩汁,P1-梨浓缩汁,P2-桃浓缩汁,B-蓝莓浓缩汁;T-以50∶50牦牛乳与豆乳比为发酵基质,接种发酵剂YF-L922、益生菌LC-01的处理组(下同)图2 冷藏期间不同处理方式的pH值及酸度变化规律Fig.2 Changes in pH and acidity of different treatments during refrigeration

2.5 浓缩果汁对发酵饮料活菌数的影响

如表4所示,添加不同浓缩果汁的发酵饮料在0～14 d冷藏期,活菌数均有所增加,冷藏至14 d后,活菌数下降。这与目前报道的发酵产品冷藏期间中活菌数的变化规律类似[24,26],冷藏期内有机酸的积累抑制了益生菌增长。由表4可知,添加蓝莓浓缩汁的产品中活菌数最低,这是因为蓝莓浓缩汁的低pH导致副干酪乳杆菌活性下降[27]。研究发现,添加梨浓缩汁的处理组活菌数最高(P<0.05),牦牛乳中的乳果糖和半乳糖、浓缩果汁中的菊糖和低聚果糖以及豆乳中的碳水化合物等益生元化合物对副干酪乳杆菌的生长具有协同作用,有助于刺激活菌数增加[28-29]。与梨、桃浓缩汁相比,添加草莓浓缩汁的处理组副干酪乳杆菌活菌数较低,可能与草莓中生物活性化合物对革兰氏阳性和阴性菌株的抑制作用有关[30]。

表4 冷藏期间的活菌数Table 4 Probiotics counts during refrigeration

2.6 浓缩果汁种类对发酵饮料感官品质的影响

由表5可知,在冷藏的第0和21天,添加梨浓缩汁的处理组风味和口感评分最高(P<0.05);添加草莓浓缩汁的处理组外观评分更高更令人满意,但风味和口感的感官评分较低。根据产品的感官属性,添加梨浓缩汁的处理组感官总分最高,可能是因为梨浓缩汁特有的清香味掩盖了豆乳中的豆腥味;而添加蓝莓浓缩汁的处理组总分最低(P<0.05),可能由于蓝莓浓缩汁酸度太高,影响了发酵饮料的风味和口感[29]。浓缩果汁对产品的风味和营养均有一定影响[29]。综合发酵饮料冷藏期间的益生菌活菌数和感官结果,添加梨浓缩汁的处理组益生菌活菌数较高且感官评分较高,因此选取梨浓缩汁添加至发酵饮料中。

表5 冷藏期间的感官评定结果Table 5 Sensory evaluation results during refrigeration

3 结论

益生菌的种类、牦牛乳与豆乳的比例以及添加浓缩果汁的类型对发酵饮料感官品质及益生菌活菌数有显著影响(P<0.05)。以副干酪乳杆菌为益生菌,m(牦牛乳)∶m(豆乳)50∶50的处理组活菌数最高,感官品质最优。选取此处理组的发酵饮料分别添加草莓、梨、桃和蓝莓浓缩汁,添加梨浓缩汁处理并冷藏的处理方式下益生菌活菌数最高且感官品质最优(P<0.05)。综上所述,从益生菌活菌数、感官属性等多方面考虑,以副干酪乳杆菌为益生菌、牦牛乳豆乳质量比为50∶50的处理方式进行发酵,发酵结束后添加梨浓缩汁冷藏处理的发酵饮料可作为一种发酵饮料。