复合生物保鲜剂的研制及其对冷却驴肉的保鲜效果

邢智彬,吴晓彤*,刘建忠,刘静

1(内蒙古大学 生命科学学院,内蒙古 呼和浩特,010021) 2(内蒙古蒙驴食品有限公司,内蒙古 呼和浩特,010010) 3(内蒙古商贸职业学院,内蒙古 呼和浩特,010070)

驴肉肉质细、滑、嫩,口感香、甜、正,营养全面,还有补气养血、健脑安神、强筋通络的保健功效[1]。驴肉销售前处理的一种方式是冷藏,由于驴肉中不饱和脂肪酸含量较高,酶类作用和微生物的繁殖作用导致油脂氧化,使驴肉极容易出现腐败变质现象,即使把生肉贮藏在0～4 ℃的环境中,肉类中的酶、嗜冷腐败菌仍对肉的品质存在威胁。生物保鲜剂是通过生物分离工程直接或间接从生物中提取的具有保鲜功效的物质[2],其多为天然提取或发酵生产,高效安全,已经成为肉类保鲜技术领域的研究热点。但几乎没有单一的保鲜剂可以对所有微生物既具有抑制其生长作用,又具有抑制肉类脂质氧化的效能,而利用因子间的协同作用,复合生物保鲜剂往往会产生较单一生物保鲜剂更好的保鲜效果[3]。

ALIREZALU等[4]发现荨麻提取物制成的聚赖氨酸涂层可以有效地延长4 ℃贮藏牛肉的货架期,而对感官品质没有负面影响。黄明焜等[5]运用复合生物保鲜剂对冷却牛肉进行保鲜处理,结果表明,使用22.5 g/L壳聚糖、0.15 g/L Nisin、9.7 g/L乳源抗菌肽、1.5 g/L茶多酚、3.0 g/L丁香精油时,冷却牛肉的货架期较空白组延长25 d以上。FANG 等[6]研究发现没食子酸/壳聚糖可食用涂层,在4 ℃的气调包装中可保持新鲜猪肉的品质,并随着没食子酸的掺入,壳聚糖涂层的抗菌活性增强。MEHDIZADEH等[7]发现蜂胶提取物和壳聚糖制成的涂层,可使样品中的微生物数量明显降低(P<0.05)。相关研究发现,当壳聚糖、茶多酚和溶菌酶的质量分数分别为1%、3%、5%时,冷鲜牛肉的总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)取极小值59.2 mg/kg,仍然保持比较新鲜的状态,能够有效地延长肉品的货架期[8];使用质量分数0.75%的壳聚糖、1.29%的茶多酚、2.91%的溶菌酶处理冷鲜牛肉,lgCFU/g最大值为5.61,低于国家规定的6.00,达到了较好的保鲜效果[9];D-异抗坏血酸钠常结合乳酸链球菌素并结合真空包装能发挥其最佳作用,起到保鲜护色的效果,有效地延长货架期[10]。

生物保鲜剂已经被证实具有传统化学防腐剂的防腐、抗氧化效果。我国作为一个肉类消费大国,生物保鲜剂原料资源丰富,上游基因编辑改造技术及下游发酵和提取技术的不断发展进步,为发展推广绿色安全的生物保鲜剂产业提供了坚实的基础。

为得到一种稳定性高、保鲜效果好的复合生物保鲜剂,同时延长冷却驴肉保鲜期,保持肉质,本文以冷却驴肉为研究对象,通过分析冷却驴肉中的优势菌相构成,确定抑制优势菌相生长繁殖的保鲜成分,设计正交试验得到复合生物保鲜剂,在第0天至第18天检测使用复合生物保鲜剂前后冷却驴肉相关理化指标的变化,探究复合生物保鲜剂对冷却驴肉的保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜驴肉：2～3岁乌驴后腿肉,蒙驴食品有限公司;真空包装袋,浙江喜之龙包装有限公司;聚赖氨酸(食品级,含量≥99.8%),陕西晨明生物科技有限公司;乳酸链球菌素(食品级),山东巨荣生物工程有限公司;壳聚糖(食品级,脱乙酰度96%),江苏普雷特生物工程有限公司;D-异抗坏血酸钠(食品级),郑州拓洋实业有限公司;戊二醛,国药集团化学试剂有限公司;叔丁醇,天津化学试剂有限公司;平板计数琼脂(plate count agar,PCA)培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar,VRBA)培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(yeast peptone dextrose agar,YPD)培养基,北京陆桥技术股份有限公司;MRS培养基,北京酷来搏科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,全式金生物科技有限公司;Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒,生工生物工程股份有限公司;引物,华大基因设计。

1.2 仪器与设备

UV-1780紫外可见分光光度计,岛津仪器有限公司;Hitachi S-4800场发射扫描电子显微镜,日本日立高新有限公司;K9840自动凯氏定氮仪,济南海能仪器股份有限公司;DZ-400/2L真空包装机,诸城市恒得利食品包装机械厂;CX21FS1C真空冷冻干燥机,北京德天佑科技发展有限公司;FD-1显微镜,奥林巴斯有限公司;5804R高速冷冻离心机,艾本德;PHS-3C雷磁pH计,济南欧莱博科学仪器有限公司;TC-96/G/H(b)C基因扩增仪,杭州博日科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 复合生物保鲜剂的配制

壳聚糖溶液：根据前期实验基础,准确称取壳聚糖7.5 g,加入500 mL 1%的冰醋酸后于75 ℃水浴溶解,搅拌30～40 min后静置30 min,真空脱气。

添加ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、D-异抗坏血酸钠至壳聚糖溶液中,搅拌使其均匀,真空脱气,得到复合生物保鲜剂涂膜液。

1.3.2 原料预处理

将分割用具消毒杀菌,剔除肉表面的筋膜及多余的脂肪和结缔组织,分割成200 g左右的肉块,于0～4 ℃冷藏备用。

实验组：冷却驴肉涂抹正交试验得到的复合生物保鲜剂最优浓度,室温放置10 min后放入真空包装袋内,于0～4 ℃冷藏,测定当天及冷藏6、12和18 d的冷却驴肉中菌落总数、挥发性盐基氮值、pH值,同时进行感官评价。每个样品做3个重复。

对照组：将冷却驴肉放入真空包装袋内,于0～4 ℃冷藏。

1.3.3 正交试验设计

参考文献[10-14],根据正交试验的设计原理,以ε-聚赖氨酸(A)、乳酸链球菌素(B)、D-异抗坏血酸钠(C)为自变量,以菌落总数、挥发性盐基氮值、pH值为响应指标,以菌落总数为主要指标,采用“综合平衡法”,确定复合生物保鲜剂最优浓度,按表1进行正交试验。

表1 L9(33)正交试验表Table 1 Factors and levels L9(33) orthogonal experimental

1.3.4 数据处理

采用Excel 2010和 Origin 8.5软件进行数据处理和作图,每组试验均重复3次并利用Minitab17.0软件进行分析,P<0.05表示有统计学显著性差异。

1.4 测定指标

1.4.1 冷却驴肉优势菌相分离和鉴定

取对照组冷却驴肉在冷藏0、6、12和18 d后,挑取PCA、VRBA、YPD、MRS培养基上外观形态不同的菌落,经纯化挑取单菌落,进行革兰氏染色,并提取基因组DNA,用通用引物27-F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1541-R(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)扩增16S rDNA片段[15]。用通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增18S rDNA片段[16]。委托通用生物系统有限公司测序及拼接序列后,在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序进行核酸序列的同源性比对。

1.4.2 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。

1.4.3 挥发性盐基氮含量测定

参照GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。

1.4.4 pH值测定

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》进行测定。

1.4.5 感官评分

参考杨春婷等[17]的方法,以可接受度作为感官评价标准,取0～4 ℃冷藏的驴肉,在当天其他指标测定前取样品测定感官评分。主要感官指标为气味、组织状态、持水性、色泽。评定标准如表2所示,8～10分为好;6～8分为中;4～6分为差;2分以下表明已变质。

表2 冷却肉感官评定评分标准Table 2 Sensory evaluation standard of chilled meat

1.4.6 微观结构的测定

参照李莎莎等[18]的方法稍作修改。将肉样垂直肌纤维方向切成3 mm×3 mm×3 mm小块,用质量分数为2.5%的戊二醛(pH 6.8)浸泡,过夜固定(4 ℃,24 h)。先用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸缓冲液浸泡3次,每次10 min。然后分别使用体积分数30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇脱水,每次10 min,再用无水乙醇(100%,体积分数)脱水2次,每次10 min,共3次。最后,采用氯仿进行脱脂1 h,离心。再用V(无水乙醇)∶V(叔丁醇)=3∶1、1∶1、1∶3以及叔丁醇各进行1次置换,每次为15 min。真空干燥后进行扫描电子显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 冷却驴肉优势菌相构成

由表3所示,对冷却驴肉样品中细菌测序可知优势菌主要为：乳酸菌、考克氏菌、藤黄微球菌、肠膜明串珠菌、志贺氏杆菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、芽胞杆菌、大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、河生肠杆菌、乡间布丘菌、成团泛菌。

由表4所示,对冷却驴肉样品中真菌测序可知优势菌主要为：酵母菌、霉菌。

如图1所示,冷却驴肉的优势菌相以肠杆菌属(Enterobacterium,31.06%)和酵母菌(yeasts,28.18%)为主,其次是乳酸菌属(Lactobacillus,21.1%)、副球菌属(Pantococcus,9.83%)、微球菌(Micrococcus,8.39%)、泛菌属(Pandora)、霉菌(mould)。由于屠宰环境、卫生条件及运输条件,导致肠杆菌在优势菌相中的占比较大。肠杆菌是一种兼性厌氧菌,在真空包装下适合其生长;而且肠杆菌对营养物质的摄取能力较强,每100 g驴肉中的蛋白质含量有22.8 g,所以肠杆菌在优势菌相中占比最大。但本试验未检出许多冷却肉中出现的假单胞菌,这可能是因为假单胞菌是一种好氧菌,在真空包装下不易存活。

表3 冷却驴肉样品细菌测序结果Table 3 Bacterial sequencing results of chilled donkey meat

表4 冷却驴肉样品真菌测序结果Table 4 Fungus sequencing results of chilled donkey meat

图1 冷却驴肉优势菌相构成Fig.1 Dominant microorganism in chilled donkey meat

选择保鲜成分时需根据冷却驴肉的初始优势菌,有针对性地选择合适的保鲜成分。相关研究表明,ε-聚赖氨酸是一种广谱抑菌保鲜剂,对酵母菌、大肠杆菌、微球菌均具有明显的抑制效果[19],但对乳酸菌的抑制效果不明显,而乳酸链球菌素能有效抑制乳杆菌的生长繁殖,且乳酸链球菌素在人体消化道中可被蛋白酶水解成氨基酸,不会影响正常的肠道菌群结构[20]。壳聚糖具有较强的抗菌性、成膜性和可食性,已广泛应用于果蔬及肉类的保鲜。D-异抗坏血酸钠不仅可以抑制各种细菌的生长,而且是一种新型生物型食品抗氧化剂、防腐保鲜、助色剂[21]。因此实验选用ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、壳聚糖、D-异抗坏血酸钠作为复合生物保鲜剂的保鲜成分。

2.2 正交试验结果分析

采用“综合平衡法”确定复合生物保鲜剂最优浓度,得到正交试验直观分析见表5,方差分析见表6。

表5 L9(33)正交试验直观分析表Table 5 Results of the orthogonal experiment of L9(33)

表6 方差分析表Table 6 ANOVA table

采用直观分析法,以菌落总数为响应指标,得到最优组合A2B3C1,因素影响的主次为：B>C>A。以TVB-N值为响应指标,得到最优组合A1B1C3,因素影响的主次为：C>B>A。以pH为响应指标,得到最优组合A2B3C1,因素影响的主次为：A>B>C。实验应用正交试验优化了保鲜剂浓度,以菌落总数为主要指标,同时考虑其他指标,采用“综合平衡法”,同时利用Minitab 17.0软件分析后得到该保鲜剂的最佳浓度为：A1B2C1,即ε-聚赖氨酸质量分数为0.02%、乳酸链球菌素质量分数为0.06%、壳聚糖质量分数为1.5%、D-异抗坏血酸钠质量分数为0.1%,此时保鲜效果最好,冷却驴肉货架期长达18 d及以上。采用此条件进行验证实验,检测复合生物保鲜剂在此浓度下对冷却驴肉保鲜效果的影响。

2.3 复合生物保鲜剂对冷却驴肉菌落总数的影响

图2显示为复合生物保鲜剂对冷却驴肉菌落总数的影响。相关国家标准中规定的冷却肉的新鲜度与微生物菌落总数关系定为一级鲜度≤4 lg CFU/g;二级鲜度为4～6 lg CFU/g;变质肉≥6 lg CFU/g。冷却驴肉在冷藏过程中,2组样品的菌落总数均随冷藏时间的延长而增长。对照组样品的菌落总数在前6 d增长缓慢,随冷藏时间的延长其增长速度加快,第18天时已增长至5.36 lg CFU/g。冷却驴肉经保鲜剂处理后,其菌落总数随冷藏时间的延长而缓慢增长,在前6 d的菌落总数数值明显低于对照组,在第18天时,菌落总数为3.97 lg CFU/g,比对照组低1.39 lg CFU/g。

图2 复合生物保鲜剂对冷却驴肉菌落总数的影响Fig.2 Effect of compound biological preservative on total bacterial count of chilled donkey meat

2.4 复合生物保鲜剂对冷却驴肉挥发性盐基氮值的影响

TVB-N值可作为评价肉品新鲜度的指标,根据GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜(冻)畜、禽产品》中肉的新鲜度与挥发性盐基氮含量关系：一级鲜肉TVB-N≤15.0 mg/100 g;二级鲜肉15.0 mg/100 g25.0 mg/100 g。如图3所示,2组冷却驴肉在冷藏过程中TVB-N值均呈现上升趋势。这说明随冷藏时间的延长,肉中的蛋白质产生的碱类物质增多,使TVB-N值增加。第0天冷却驴肉初始TVB-N值为9.33 mg/100 g,到第18天对照组冷却驴肉的TVB-N值为15.89 mg/100 g,经保鲜剂处理后的冷却驴肉TVB-N值为11.45 mg/100 g,说明保鲜剂处理后的冷却驴肉TVB-N值上升速度比对照组缓慢。对照组TVB-N值逐渐升高是由于刚屠宰的胴体本身可认为是无菌的,屠宰后受到环境中微生物的污染,随着时间的延长,微生物数量越来越多,导致TVB-N值升高;而实验组TVB-N值升高缓慢可能是由于动物被屠宰后,肌肉的pH值下降,同时复合生物保鲜剂对细菌的繁殖有抑制作用。试验结果表明,经保鲜剂处理18 d后的冷却驴肉仍在一级鲜度范围内,说明采用复合生物保鲜剂处理冷却驴肉能够起到良好的保鲜效果。

图3 复合生物保鲜剂对冷却驴肉挥发性盐基氮值的影响Fig.3 Effect of compound biological preservatives on volatile basic nitrogen of chilled donkey meat

2.5 复合生物保鲜剂对冷却驴肉pH值的影响

pH值可作为评价肉品新鲜度的指标,根据GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜(冻)畜、禽产品》中肉的新鲜度与pH关系：一级鲜度pH 5.80～6.20;二级鲜度pH 6.30～6.60;变质肉pH>6.70。如图4所示,在冷藏过程中,2组冷却驴肉的pH值均呈现先下降后上升的趋势,这可能是因为在冷却肉贮藏的初期,因为肉品自身组织细胞还有呼吸作用,肌糖原发生无氧酵解,ATP磷酸化供能,产生了磷酸、乳酸等酸性物质,导致肉品的pH值降低[23]。之后由于微生物的作用,蛋白质、氨基酸被分解,产生胺类及含氮的碱性物质,在这些碱性物质的逐步积累下,肉的pH值开始逐渐上升,到后期微生物的含量多,使pH值增长速率有所加快,导致肉品pH值逐渐升高。第0天时冷却驴肉初始pH值为5.88,对照组和实验组均在第6天达到最低值,分别为5.77和5.66;到第18天时实验组样品的pH达到5.87,推测可能是由于壳聚糖是由冰乙酸溶液配制的,因此使得肉品的pH值较低。试验结果表明,经复合生物保鲜剂处理18 d后的冷却驴肉仍在一级鲜度范围内。

图4 复合生物保鲜剂对冷却驴肉pH值的影响Fig.4 Effect of compound biological preservative on pH value of chilled donkey meat

2.6 复合生物保鲜剂对冷却驴肉感官品质的影响

由图5可知,冷却驴肉在冷藏过程中,感官品质均呈现下降的趋势。当冷藏时间达到第18天时,未经保鲜剂处理的冷却驴肉感官评分为5分,此时冷却驴肉的异味浓,肌肉在指压后不能恢复,外表黏手,汁液流失多,肌肉无光泽呈暗红褐色。经保鲜剂处理后的冷却驴肉感官评分为7分,此时冷却驴肉无异味,肌纤维纹路基本清晰。与未处理组冷却驴肉相比,经保鲜剂处理后的冷却驴肉感官评分下降速度缓慢,这可能是由于复合生物保鲜剂中聚赖氨酸、乳酸链球菌素和壳聚糖等抑菌成分抑制了肉中腐败微生物的生长繁殖,这与菌落总数的变化相一致,同时,D-异抗坏血酸钠保护了冷却驴肉的颜色,对感官品质有较好的影响。

图5 复合生物保鲜剂对冷却驴肉感官品质的影响Fig.5 Effect of compound biological preservatives on sensory quality of chilled donkey meat

2.7 复合生物保鲜剂对冷却驴肉肌肉微观结构的影响

由图6可知,未经保鲜剂处理的冷却驴肉和经保鲜剂处理18 d后的冷却驴肉肌肉组织基本无明显差异,2组驴肉肌肉组织较为完整,肌纤维清晰整齐,结缔组织无明显分离。肌肉由肌纤维和结缔组织膜聚集而成的肌束构成,而肌纤维是一个多核细胞,由许多平行排列的肌原纤维组成[24]。2组肌肉组织的微观结构表明复合保鲜剂对驴肉的肌肉组织基本无改变,可以维持驴肉本身的肌肉组织特点,肌肉组织完整。

a-第0天未处理的冷却驴肉;b-第18天保鲜剂处理的冷却驴肉图6 复合保鲜剂对肌肉微观结构的影响Fig.6 Effect of compound preservative on muscle microstructure

3 结论

试验结果表明,ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、D-异抗坏血酸钠和壳聚糖对冷却驴肉中的优势菌(乳酸菌、肠杆菌、微球菌、酵母菌)均有很好的抑制效果。得到复合生物保鲜剂中聚赖氨酸质量分数为0.02%、乳酸链球菌素质量分数为0.06%、壳聚糖质量分数为1.5%、D-异抗坏血酸钠质量分数为0.1%,经复合生物保鲜剂处理后,冷却驴肉在0～4 ℃下冷藏可达18 d及以上,有效地延长冷却驴肉货架期的同时,菌落总数、TVB-N、pH值较小,新鲜度较高。经扫描电镜观察冷却驴肉微观肌肉组织发现,保鲜剂处理18 d后驴肉肌肉组织仍完整。同时该复合生物保鲜剂所用原料具有天然生物无害、对环境污染少、对冷却驴肉风味影响不大和操作易控制的优势。