HPLC法测定钙镁维生素D咀嚼片中维生素D3的含量

张建喜，姚玲平，陈活林，刘剑萍

(1.浙江创新生物有限公司，浙江 绍兴 312000；2.浙江医药股份有限公司新昌制药厂，浙江 新昌 312500)

0 引言

维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)[1]。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物，植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。维生素D是一种脂溶性维生素，有五种化合物，对健康关系较密切的是维生素D2和维生素D3。它存在于部分天然食物中；人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇，受紫外线的照射后，可转变为维生素D3，适当的日光浴足以满足人体对维生素D的需要[2]。钙镁维生素D咀嚼片以碳酸钙、维生素D3、氧化镁为主要成分，每片含标志性成分维生素D34.2 μg，产品规格为1.35 g/片，可补充维生素D，促进钙吸收有助于骨骼和牙齿的健康，有助于骨骼形成[3]。产品中维生素D3含量较低，目前对于保健食品中维生素D3含量测定方法多为食品安全国家标准方法，但测定过程过于繁琐，检测周期长，且测定结果较难重现。参考文献资料中维生素D测定方法研究内容[4-6]，本文通过实验研究建立了较为简便的HPLC法测定钙镁维生素D咀嚼片中维生素D3含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；METTLER-TOLEDO XS205DU型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；戊醇、正己烷(默克，色谱纯)；其余试剂均为分析纯；维生素D3对照品(批号：100061-201809)为中国药品食品检定研究院提供；钙镁维生素D咀嚼片样品为自制(批号为MD200401、MD200402、MD200403)。

1.2 色谱条件

硅胶色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为戊醇：正己烷(3∶997)；紫外检测器，检测波长为254 nm；流速为2.0 mL/min；进样量为100 μL；柱温30 ℃。

1.3 溶液配制

样品溶液：取片剂研碎，称取5.0 g，精密称定，置于100 mL带塞子的锥形瓶中，加入二甲亚砜与水的混合溶液(体积比3∶1)25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加热10 min，不断振摇，冷却后，精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层过滤后用于液相测定。

对照贮备溶液：称取维生素D3对照品约20 mg，精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲苯不加热溶解，并稀释至刻度。精密吸取上述溶液1.0 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，作为对照贮备溶液。

对照溶液：精密吸取对照贮备溶液1.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加正己烷稀释至刻度。将溶液转入到100 mL带塞子的锥形瓶中，加入二甲亚砜-水(体积比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层过滤后用于液相测定。

1.4 检测方法

取对照溶液与样品溶液各100 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积按外标法计算样品中维生素D3的含量。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂筛选

产品配方中维生素D3以维生素D3微粒的形式存在，其微粒以维生素D3与β-环状糊精为原料，经溶解、回流、冷却、离心、干燥等工艺制成。片剂配方中还使用到碳酸钙、氧化镁为主要原料，山梨糖醇、麦芽糊精、乳粉、乳糖、硬脂酸镁、羟丙基甲基纤维素、二氧化硅等为辅料，经制粒、混合、压片、包装等工艺加工制成钙镁维生素D咀嚼片。使用国家标准GB 5009.82检测维生素D3，皂化后萃取过程中乳化严重，无法完成试验。结合产品配方特点，考虑维生素D3的提取尤为关键。

β-环状糊精是淀粉经酸解环化生成的产物，为新型分子包裹材料，溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮。维生素D3为脂溶性维生素，在水中不溶，在正己烷、乙醚等非极性溶剂中易溶解。产品配方中其他物料均在正己烷中不溶，部分辅料可在水及二甲亚砜溶剂中溶解，结合产品配方，使用水作为破壁溶剂，50 ℃水浴中加热振摇，冷却后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min搅拌20 min，乳化严重，无法分层。

水中加入甲醇及二甲亚砜，可以减少乳化现象，改用二甲亚砜与水的混合溶液(体积比3∶1)作为破壁溶剂，50 ℃水浴中加热振摇，冷却后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min搅拌20 min，乳化减弱，但分层时间较长。

优化破壁提取过程，改用二甲亚砜与水的混合溶液(体积比3∶1)作为破壁溶剂，加入甲醇，50 ℃水浴中加热振摇，冷却后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min搅拌20 min，乳化减弱，分层时间减少。

2.2 对照溶液及样品溶液浓度确定

称取维生素D3对照品约20 mg，精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲苯不加热溶解，并稀释至刻度，作为贮备溶液，精密移取贮备溶液，用正己烷定量稀释。在安捷伦1260液相色谱仪进样，记录色谱图。维生素D3浓度为0.6 μg/mL时，峰面积为80，能满足定量需求。

钙镁维生素D咀嚼片功效成分维生素D3含量为4.2 μg/片，产品规格1.35 g/片，折算后样品量称取5 g溶解破壁后，用25 mL正己烷提取，样品溶液与对照溶液中维生素D3浓度相近。

2.3 二甲基亚砜水混合溶液量的选择

取钙镁维生素D咀嚼片研碎后，称取粉末5.0 g，加入一定量体积的二甲亚砜与水的混合溶液(体积比3∶1)，在50 ℃水浴中加热振摇10 min，然后加入甲醇10 mL，加入正己烷25 mL，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层过滤后进样测定，考察溶解破壁溶剂量对维生素D3测定结果的影响，结果如表1所示。

表1 二甲基亚砜水混合溶液量的选择数据表

2.4 溶解破壁温度的选择

取钙镁维生素D咀嚼片研碎后，称取粉末5.0 g，加入25 mL二甲亚砜与水的混合溶液(体积比3∶1)，在不同温度水浴中加热振摇10 min，然后加入甲醇10 mL，加入正己烷25 mL，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层过滤后进样测定，考察溶解破壁温度对维生素D3测定结果的影响，结果如表2所示。

表2 溶解破壁温度选择数据表

2.5 加入正己烷后搅拌时间的选择

取钙镁维生素D咀嚼片研碎后，称取粉末5.0 g，加入25 mL二甲亚砜与水的混合溶液(体积比3∶1)，在不同温度水浴中加热振摇10 min，然后加入甲醇10 mL，加入正己烷25 mL，800 r/min搅拌不同时间，静置分层，取上层正己烷层过滤后进样测定，考察搅拌时间对维生素D3测定结果的影响，结果如表3所示。

表3 搅拌时间选择数据表

2.6 专属性试验

取不含维生素D3空白辅料5.0 g按照钙镁维生素D咀嚼片处理方法，置于100 mL带塞子的锥形瓶中，加入二甲亚砜与水(体积比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加热10 min，不断振摇，冷却后，精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层制成空白辅料溶液。再取二甲亚砜与水混合溶液(体积比3∶1)25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加热10 min，不断振摇，冷却后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层制成空白溶液。分别取空白辅料溶液、空白溶液、对照溶液与样品溶液，进样并记录色谱图，空白溶液及空白辅料溶液无干扰，空白溶液图谱如图1所示，空白辅料溶液图谱如图2所示，对照溶液图谱如图3所示，样品溶液图谱如图4所示。

图1 空白溶液图谱

图2 空白辅料溶液图谱

图3 对照溶液图谱

图4 钙镁维生素D咀嚼片样品溶液图谱

2.7 精密度试验

取同一对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，结果维生素D3峰面积为86.14、85.95、86.38、86.40、86.56、87.30，RSD为0.6%，表明仪器精密度良好。取同一批样品，依法平行操作制备6份供试品溶液，分别测定，结果维生素D3含量分别为5.86 μg/片、5.85 μg/片、5.89 μg/片、5.91 μg/片、5.94 μg/片、6.00 μg/片，平均值为5.91 μg/片，RSD为1.0%。不同分析员在不同时间使用不同仪器对同一批样品进行测定，5.54 μg/片、5.61 μg/片、5.59 μg/片、5.62 μg/片、5.37 μg/片、5.62 μg/片，平均值为5.56 μg/片，RSD为1.8%。不同人员及仪器测定结果差值为其平均值的6%，结果一致，表明方法精密度良好。

2.8 标准曲线的绘制和线性关系的考察

精密称取维生素D3对照品约20 mg置于25 mL棕色容量瓶中，用甲苯溶解稀释到刻度，移取1.0 mL该溶液到50 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀释到刻度，作为线性贮备溶液。分别移取线性贮备溶液0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL到25 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀释到刻度，将溶液转入到100 mL带塞子的锥形瓶中，精密加入二甲亚砜-水(体积比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层，配制成维生素D3浓度为0.2～0.8 μg/mL的线性溶液，分别进样并记录色谱图，以维生素D3浓度为横坐标，维生素D3峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算线性方程和相关系数，得到线性方程为y=135.54x-2.245 6，线性相关系数为0.999 9，结果表明维生素D3在线性范围内呈良好的线性关系，结果如表4所示。

表4 线性数据表

2.9 加样回收率试验

称取5.0 g不含维生素D3的空白辅料，精密称定，置于100 mL带塞子的锥形瓶中，加入二甲亚砜与水(体积比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加热10 min，不断振摇，冷却，作为本底溶液。精密称取维生素D3对照品约20 mg置于25 mL棕色容量瓶中，用甲苯溶解稀释到刻度，移取1.0 mL该溶液到50 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀释到刻度，作为贮备溶液。分别移取贮备溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL到25 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀释到刻度，配制成50%、100%、200%的标准溶液，分别在本底溶液中加入配制好的系列标准溶液，800 r/min搅拌20 min，静置分层，取上层正己烷层，制成对照溶液浓度水平50%、100%、200%的维生素D3回收率测定溶液，依法处理并测定，计算加样回收率，结果如表5所示。结果表明该方法具有较好的准确度。

表5 加样回收率数据表(n=3)

2.10 溶液稳定性试验

配制对照品溶液和供试品溶液，分别在避光的条件下室温放置48 h后进样检测，放置后与0 h检测结果相比，对照品溶液峰面积基本一致，供试品溶液测定结果为5.76 μg/片，基本一致，表明溶液在室温避光的条件下48 h内稳定。

2.11 耐用性试验

分别改变测试条件，如改变流动相的比例、柱温、流速及更换仪器色谱柱，依法测定，结果与标准条件下测定结果一致，表明本方法具有良好的耐用性，结果如表6所示。

表6 耐用性数据表

2.12 样品含量测定

取钙镁维生素D咀嚼片样品，分别在本实验、通标标准技术服务(上海)有限公司(SGS)依法测定，结果如表7所示，均符合规定。

表7 钙镁维生素D咀嚼片样品测定维生素D3结果

2.13 讨论

本品中维生素D3以β-环状糊精包埋微粒的形式存在，实验过程中需先用二甲亚砜水溶液(体积比3∶1)在50℃水浴中溶解破壁，使维生素D3游离出来，且需加入甲醇减少乳化，然后用正己烷提取，为消除实验过程中可能产生的系统误差，供试品与对照品的前处理过程完全一致，均为经正己烷溶液提取，HPLC检测，以峰面积，按照外标法计算样品中维生素D3含量，操作简便，由于产品中维生素D3含量较低(约3 μg/g)，中国药典对应含量准确度要求80%～115%，精密度要求RSD≤6%，该方法能符合药典要求，结果准确可靠。

3 结语

方法学验证表明，样品研碎后，取粉末用二甲亚砜与水的混合溶液(体积比3∶1)25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加热10 min，不断振摇，破壁溶解，使其中的维生素D3游离出来，然后用正己烷25.0 mL，800 r/min搅拌20 min，提取溶液中的维生素D3，静置分层后，取上层正己烷层过滤，用于测定钙镁维生素D咀嚼片中维生素D3含量，该方法具有良好的专属性、精密度、线性和准确度，方法较为简便，准确可靠，并经过通标标准技术服务(上海)有限公司(SGS)复核，适用于钙镁维生素D咀嚼片中维生素D3含量检测。