血清(1,3)-β-D-葡聚糖测定主试剂溶解方式不同对检测结果的影响

黄日昇，彭云娟，李轶春

北海市中医医院医学检验科，广西 北海 536000

长期以来，由于抗生素、激素、抗肿瘤化疗与放疗药物、免疫抑制剂、留置管和器官移植的广泛应用，临床机会性真菌感染的发病率和死亡率逐年上升[1-3]，真菌已成为医院感染的主要病原体之一。(1,3)-β-D-葡聚糖[(1,3)-β-D-glucan，BDG]是真菌细胞壁的主要成分，其含量可达到50%以上，其他微生物尚未发现有此物质[4]，因此其成为深部真菌感染研究的热点[5]。血清(1,3)-β-D-葡聚糖测定(G试验)适用于除了隐球菌、接合菌(毛霉菌)外的深部真菌感染早期诊断，是目前应用于侵袭性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)辅助诊断最常用的非侵袭性血清学方法[6]。但在实际临床案例中发现G试验假阳性或假阴性率较高，影响其结果的因素较多，而实验操作过程中反应主试剂溶解方式的不同是主要影响因素之一，却没有得到足够的重视。本文旨在通过对G试验(光度法)反应主试剂采用手工振荡溶解与仪器振荡溶解的检测结果进行比较研究，分析主试剂不同溶解方式对检测结果的影响，提高G试验的敏感度与特异度。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年6～12月北海市中医医院重症医学科、肺病科、肿瘤科长期使用广谱抗菌药物、免疫抑制剂、糖皮质激素、正在化疗或放疗的126例有临床感染症状拟诊IFI患者为研究对象，其中男性78例，女性48例，平均年龄(62.55±5.58)岁。本研究获得医院医学伦理委员会批准，所有患者知情同意。本研究参考欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)的诊断标准和中国侵袭性真菌感染工作组制定的临床诊断侵袭性真菌病的诊断标准[7]：(1)确诊：组织病理学证实为真菌，无菌组织及血液培养为真菌；(2)临床诊断：具有IFI宿主因素及临床表现，同时伴有一项病原学依据；(3)临床拟诊：具有IFI宿主因素及临床表现，无病原学依据，抗真菌治疗有效；(4)排除诊断：不符合以上标准，单用抗菌药物治疗有效。IFI感染患者为确诊和临床诊断患者；不符合上述诊断标准，而明确细菌、病毒感染者为非侵袭性真菌感染患者。按照IFI确诊标准将126 例患者分为感染组60 例和未感染组66例。

1.2 仪器与试剂 北京金山川MB-80 快速动态微生物检测系统、MI-01 智能金属浴、KJ-201C 微量振荡器；试剂：北京金山川科技有限公司生产的真菌(1,3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒(光度法)，GKT-1M包装规格，主要组成包括反应主试剂(成分：G因子、凝固酶原、凝固蛋白原。规格：冻干品，冻干前体积0.2 mL/支)、样品处理液(成分：表面活性剂0.05%，K+0.01 mol/L，Mg2+0.02 mol/L。规格：0.9 mL/支)；配套材料：喜诺促凝剂型采血管、无热源专用平底试管、一次性无热源吸头。

1.3 方法

1.3.1 G试验反应主试剂手工振荡与仪器振荡溶解方法 选择专用喜诺促凝剂型采血管采集静脉血4 mL，3000 r/min 离心10 min，取上层血清0.1 mL，加入0.9 mL 样品处理液中，使用移液器混匀后，在70℃的MI-01 智能金属浴加热15 min，然后自动启动冷却程序，冷却5 min，此时的处理液上层为待测样品。取该上层样品0.2 mL(切忌震荡)加入到反应主试剂瓶子中(冻干品，冻干前体积0.2 mL/支)，反应主试剂手工振荡溶解方式是使用手指轻轻敲振试剂瓶，肉眼判断冻干品试剂完全溶解至无色透明；而反应主试剂仪器振荡溶解方式，则使用KJ-201C 微量振荡器振荡反应主试剂瓶10 s 或20 s 以上，然后分别将这两种溶解方法的复溶液移液至无热源专用平底试管中(避免气泡)，将其插入MB-80 仪进行测定，反应结束后，标准曲线将自动计算待测血清中BDG的含量，以此比较反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解方式不同对检测结果的影响。两种溶解方式的敏感度和特异度计算公式为：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)。试剂盒检验结果解释：＜60 pg/mL，无深部真菌感染(隐球菌、接合菌除外)；60～100 pg/mL，为观察期，应连续监测；＞100 pg/mL，怀疑为深部真菌感染，建议临床结合症状治疗(本次研究判定为阳性检测结果)。

1.3.2 质量控制 使用同一批号试剂盒配套质控品(含BDG112.5 pg/mL，靶值225 pg/mL，质控范围160～290 pg/mL)与样本一同检测，使用常规质量控制规则。

1.3.3 数据资料收集整理 通过卫宁健康常规检查系统与临床信息系统CIS采集分析。

1.4 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验，计量资料符合正态分布，以均值±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t检验。均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的G 试验反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解检测结果比较 感染组与未感染组患者G 试验反应主试剂仪器振荡溶解方法较手工振荡溶解方法有较低的标准差，两组两种溶解方法检测结果比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。感染组G 试验反应主试剂手工振荡溶解方法与仪器振荡溶解方法检测结果的敏感度分别为81.7%、90.0%；未感染组两种溶解方法检测结果的特异度分别为84.8%、92.4%。两种方法检测结果的敏感度和特异度比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。后者检测结果敏感度与特异度分别较手工溶解方法提高8.3%与7.6%，见表2。

表1 感染组与未感染组反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解检测结果比较(±s)

表1 感染组与未感染组反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解检测结果比较(±s)

组别感染组未感染组t值P值例数6066手工振荡复溶方法(pg/mL)137.27±45.8654.79±21.5412.780.001仪器振荡复溶方法(pg/mL)119.73±26.0545.50±16.1718.970.001

表2 两组患者的反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解阳性率比较[例(%)]

2.2 G 试验反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解方法室内质控失控率比较 反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解后，同时使用同一批号试剂盒附带质控品进行检测，随机挑选112 d 室内质控数据，分析室内质控失控率，仪器振荡较手工振荡溶解方法失控率降低8.04%，差异有统计学意义(χ2=7.74，P=0.010＜0.05)，见表3。

表3 手工振荡与仪器振荡溶解方法室内质控失控率比较[例(%)]

2.3 G 试验反应主试剂手工振荡溶解与仪器振荡溶解方法室内质控统计数值比较 随机挑选30 d室内质控数据进行独立样本t 检验分析，手工振荡溶解与仪器振荡溶解检测结果的室内质控统计数值均值分别为(241.41±47.35)pg/mL、(209.37±8.97)pg/mL，显示使用仪器振荡溶解方法所获得的检测结果均值更接近靶值(225 pg/mL)，明显降低了标准差，差异有统计学意义(t=3.64，P＜0.05)。

2.4 仪器振荡溶解方法振荡时间长短对室内质控数值影响 随机挑选30 d 室内质控数据进行独立样本t 检验分析，仪器振荡溶解10 s与20 s以上两种方法，其室内质控统计数值均值分别为(209.88±1.65)pg/mL和(209.27±1.33) pg/mL，两种方式检测结果的均值均接近靶值(225 pg/mL)，均有较低的标准差，同时显示均值、标准差与仪器振荡时间延长(＞10 s)非线性关系，差异无统计学意义(t=1.56，P＞0.05)。

3 讨论

IFI 为常见疾病，主要由真菌侵入人体血液或组织，并生存和繁殖，进而引起相应组织器官损伤或发生炎症反应，严重威胁患者生命健康安全[8]。G试验具备操作简便、敏感度和特异度均较高等优势，广泛应用于临床，成为IFI早期诊断的常用检测方法[9]。

目前，G试验多数采用BDG抗原检测法检测BDG含量，BDG可特异性激活鲎变形细胞裂解产物中的G因子，从而激活凝血酶原形成凝固酶，使裂解物凝固。主要通过以下两种方法检测BDG浓度：一种是比浊法(浊度法)，即根据凝固后浊度增加引起吸光度或透光率的变化来检测BDG含量。另一种是显色法(光度法)，即在试剂中加入显色底物，活化的凝固酶将底物中的黄色发光基团(对硝基苯胺)释放出来，通过吸光度的变化来检测BDG 含量[10]。因此G试验反应主试剂(冻干品)是否完全溶解，将影响吸光度或透光率的变化，从而影响实验结果的准确性。

有研究报道，较多干扰因素可引起G试验假阳性结果，极大影响了G 试验的敏感度与特异度[11-14]。最新研究显示BDG 形态均一性也是影响G 试验的因素之一，BDG 以三螺旋结构为主，但同时也存在单链和双螺旋结构等其他形态。目前对样本进行前处理主要有加热稀释法和碱处理法，前者很难使BDG形态均一化[15]，而后者可使多聚体形态转化为单链结构，从而获得均一的BDG[16]。因此有学者提出用碱处理法提高试验的特异度，但碱处理法可能需要自动化仪器设备，更高的检测成本。通过文献搜索显示，大量学者研究更倾向利用G 试验联合痰真菌培养与半乳甘露聚糖抗原检测(GM试验)来提高IFI早期诊断的敏感度与特异度，而在原有仪器设备基础上，通过优化G试验检测流程，改良G试验主试剂溶解方式等方面的应用研究却被忽视，未能得到足够的重视[9-10，17-18]。

目前关于G 试验反应主试剂溶解的标准操作要求、振荡溶解时间长短、原理、影响因素等方面的研究报道极少。在本研究中，实验结果显示感染组反应主剂手工振荡溶解后检测结果的敏感度与未感染组反应主剂手工振荡溶解后检测结果的特异度分别为81.7%、84.8%，与孟文晴等[9](82.1%、85.5%)、黄永杰等[18](82.30%、85.42%)研究基本一致，而使用仪器振荡溶解后的检测结果显示，其显著提高了感染组的敏感度(90.0%)与未感染组的特异度(92.4%)，降低了标准差。原因可能是仪器振荡溶解的频率、力度控制比手工法更恒定均匀，能使反应主剂中的G 因子、凝固酶原等内容物彻底溶解，从而更容易被样本中的BDG 特异性激活，使检测的敏感度和特异度增加。室内质控统计数值均值结果也显示，仪器震荡溶解法检测结果的均值更接近靶值，降低了G试验(光度法)检测结果的失控率与标准差。同时通过仪器振荡复溶10 s 与20 s 两种方法检测结果差异无显著性推测，仪器振荡10 s已经可以充分溶解反应主试剂(冻干品)内容物，不会造成其溶解不完全，避免了因残留的冻干品颗粒增多，而导致吸光度增加引起的假阳性。

综上所述，在相同的条件下，G实验(光度法)反应主试剂采用仪器振荡(振荡10 s即可)溶解方式的检测结果与手工振荡溶解检测结果相比，前者能降低G试验的标准差，提高检测的敏感度与特异度。