2个携带线粒体12S rRNA A1555G和tRNAThr突变的聋病家系分析

2022-04-18王欢张雨霖许育绚丁禹

浙江临床医学 2022年3期

王欢张雨霖许育绚丁禹

耳聋是一种常见的疾病，严重困扰人类的生活。有研究显示，每1,000个新生儿中有1～3例听力障碍，且约30%成年人在＞65岁出现明显的听力下降［1-2］。遗传因素和环境因素均可以引起听力下降，其中约50%耳聋由遗传因素引起［3］，遗传方式可表现为常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁和母系遗传等［4］。母系遗传中，线粒体12S rRNA基因是氨基糖甙类抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）导致的非综合征型听力损失的一个突变热点区域。其中，位于12S rRNA高度保守解码区的A1555G和C1494T突变与耳聋相关，可导致较多患者对AmAn敏感［5］。除了12S rRNA基因外，线粒体tRNA（mitochondrial tRNA，mt-tRNA）也是耳聋相关的突变热点区域，近年来有研究发现，tRNASer（UCN）A7445G［6］，tRNAIle A4317G［7］，tRNAThrG15927A［8］突变和耳聋有关。本研究分析2个携带线粒体12S rRNA A1555G突变的聋病家系，并对其做了临床和分子遗传学的评估。

1 资料与方法

1.1 临床资料本课题组前期收集耳聋患者213例，其中男108例，女105例；年龄21～76岁，中位年龄45岁。正常对照120例，其中男66例，女54例，年龄19～55岁，中位年龄39岁。本项目经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 线粒体12S rRNAA1555G突变筛查将患者样本统一编号，数据录入后提取基因组DNA。使用大连宝生物有限公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 4.0试剂盒提取基因组DNA，并进行浓度和纯度的鉴定。对有些低浓度、纯度的样本在1.5%琼脂糖凝胶（EB浓度为0.5 μg/mL）上电泳，进一步验证基因组DNA是否提取成功。使用以下引物扩增12S rRNA基因：正向：5'-CGATCAACCTCACCACCTCT-3'；反向：5'-TGGACAACCAGCTATCACCA-3'，PCR后取5 μL的产物进行电泳分析，并对PCR扩增产物纯化，送华大基因测序，测序结果用DNAstar和Chromas 2.0软件与校正后的人类线粒体剑桥参考序列（revised Cambridge Reference Sequence，rCRS，GenBank Accession Number：NC_012920.1）［9］比对，读取12S rRNA变异结果。

1.3 2个携带线粒体A1555G突变的家系分析经过详细的遗传咨询，鉴定了2个母系遗传的耳聋家系（SXD-10；SXD-15），见图1。耳聋患者经过绍兴市柯桥区妇幼保健院耳鼻喉科门诊的详细病史调查和体格检查，以确定是否有综合征性耳聋的临床表现，是否有AmAn的使用史以及是否有其他致聋的环境因素。其中听力学检查包括纯音测听（pure tone audiometry，PTA）、听觉脑干反应（auditory brainstem response，ABR）、声阻抗以及畸变产物耳声发射（distortion product otoacoustic，DPOAE），纯音测听以听力水平的分贝（dB）值为单位进行测量，并以频率500、1,000、2,000、4,000、8,000 Hz的听阈平均值计算，将听力损失的严重程度分成5级，正常＜25 dB，轻度聋25～40 dB，中度聋＞ 40～60 dB，重度聋＞60～90 dB，极重度聋＞90 dB［10］。

图1 2个携带线粒体A1555G突变的聋病家系，箭头所指的是先证者

1.4 线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变筛查对2个家系的母系成员（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）进行基因组DNA提取，使用24对引物进行线粒体基因组的PCR扩增［11］。对全部PCR产物进行纯化、测序，将测序结果和rCRS比对，判断变异位点。

1.5GJB2基因突变筛查使用正向引物：5'-TATGACACTCCCCAGCACAG-3'；反向引物：5'-GGGCAATGCTTAAACTGGC-3'对母系成员（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）进行GJB2基因的PCR扩增，扩增产物经过纯化后送至华大基因测序，测序结果与GJB2基因的标准序列［12］进行比对，筛选突变位点（GenBank Accession Number：M86849）。

2 结果

2.1 线粒体A1555G突变筛查对213例耳聋患者和120例正常对照个体进行线粒体A1555G突变筛查。首先扩增线粒体12S rRNA基因，随后进行Sanger测序分析，共鉴定了2个携带A1555G突变的个体，但该突变在正常对照个体中未被发现。经过对先证者详细的遗传咨询后，发现这2个家系具有较为明显的母系遗传。见图2。

图2 线粒体A1555G突变鉴定：A. 线粒体12S rRNA基因PCR扩增电泳图；B. 线粒体A1555G突变测序鉴定

2.2 2个携带线粒体A1555G突变家系的临床资料这2个家系主要生活在绍兴市柯桥区，在SXD-10家系中，先证者（II-8），女，61岁，从小有AmAn的用药史，剂量不明。用药后双耳听力下降，纯音测听，声阻抗，ABR等临床检测提示双侧极重度耳聋，其中右耳的PTA为90 dB，左耳的PTA为80 dB。先证者的2个弟弟（II-3和II-5）也有不同程度的听力损失，其中II-3还有AmAn的用药史。先证者的儿子（III-5）也是耳聋患者，右耳的PTA为55 dB，左耳的PTA为75 dB。该家系共3代15人，母系成员共6人，患病人数4人，耳聋的外显率为66.7%。其他成员听力正常，无糖尿病、心血管疾病、视觉障碍等其他疾病。在SXD-15家系中，先证者（III-9），女，35岁，听力检测提示右耳和左耳的PTA均为80 dB，属于重度耳聋。经过详细的遗传咨询，发现先证者的哥哥（III-6），母亲（II-6），姨妈（II-4）和外婆（I-2）均为耳聋患者，其中II-4和II-6有AmAn的用药史，用药剂量不详。该家系共4代21人，母系成员8人，患病数5人，耳聋的外显率为62.5%。家系的其他成员听力正常，无糖尿病、心血管疾病、视觉障碍等其他疾病，见表1。

表1 两个携带线粒体A1555G突变的耳聋家系母系成员临床资料

2.3 线粒体基因组的突变分析对这2个家系的母系成员（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）的线粒体基因组进行PCR扩增并进行测序分析，见表2。发现在D-Loop区含有14个变异位点，在12S rRNA上有5个突变位点，16S rRNA上有3个突变位点，在tRNAThr上有2个突变位点（A15924G和G15927A），其余的突变主要集中在蛋白编码区，其中错义突变共有7个：ND2 C5178A（Leu→Met）和A5301G（Ile→Val），A8 C8414T（Leu→Phe），A6 A8701G（Thr→Ala）和A8860G（Thr→Ala），ND5 G13708A（Ala→Thr），CytB A15326G（Thr→Ala）。随后对这些变异位点在不同物种间（包括人、牛［13］、鼠［14］、爪蟾［15］）的mtDNA进行种系进化保守分析，除12S rRNA A1555G，tRNAThrA15924G和G15927A突变外，其余突变在进化上均不保守。

表2 两个携带A1555G突变的耳聋家系母系成员线粒体基因变异汇总表

2.4GJB2基因突变筛查GJB2是导致遗传性非综合征型耳聋最常见的基因［16］。对这2个家系的母系成员（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）进行GJB2基因突变筛查，在这两个家系中并未发现GJB2基因的突变位点，提示GJB2在耳聋的表型表达中并不起作用。

3 讨论

本研究首先对213例耳聋患者和120例正常对照个体进行线粒体A1555G突变的筛查，经过测序分析发现有2个耳聋患者携带A1555G突变。当发生A1555G突变时，线粒体核糖体A位形成了一个新的1494C-G1555碱基配对，使得12S rRNA基因在二级结构上与E.coil16S rRNA相应解码区更加相似，从而增强AmAn药物在12S rRNAA位的结合力［17］。转线粒体细胞系生化功能研究发现：A1555G突变可以导致线粒体功能障碍，且对AmAn具有超敏性［18］。在无AmAn存在时，携带A1555G突变的家系母系成员在外显率、听力损失程度和发病年龄方面存在较大差异，表明A1555G突变本身尚不足以造成耳聋，其他修饰因子如AmAn、线粒体单倍型和核修饰基因等可能参与调节耳聋的外显率和表型表达［19］。

对2个携带A1555G突变的耳聋家系进行分析后发现，这2个家系中患者仅表现为听力障碍单一的临床症状，且呈现典型的母系遗传特征，提示耳聋的发病与mtDNA突变有关。对先证者和母系成员的线粒体基因组突变分析后发现，存在A1555G突变和tRNAThr突变（A15924G和G15927A），分别属于东亚线粒体单体型B4c1和B5b1［20］。从结构上看（见图3），A15924G和G15927A突变均发生在tRNAThr的反密码子环上，其中A15924G突变破坏了原有的（29T-37A）Watson-Crick碱基配对，而G15927A突变破坏了原有高度保守的（26C-40G）的碱基配对。A15924G突变被报道和线粒体脑肌病有关［21-22］，而G15927A突变被报道和冠心病［23］、Leber视神经病变有关［24］。转线粒体细胞功能学研究发现：G15927A突变显著降低tRNAThr的稳定性和氨基酰化水平［25］。因此，线粒体A15924G和G15927A突变通过改变tRNAThr的二级结构，进而导致tRNA代谢紊乱，使得线粒体蛋白合成受阻，加剧A1555G突变引起的线粒体功能障碍，是耳聋有关的继发性突变位点。由于并未筛查到GJB2基因任何有意义的突变位点。因此，在这2个家系中，线粒体tRNAThrA15924G和G15927A突变可能是影响耳聋表型表达的重要因素。对有耳聋家族史的个体，早期筛查mtDNA突变是有必要的，这为降低耳聋的发病率，预防药物性耳聋具有重要的临床意义。