东北黑土不同粒级有机质化学特征及其对长期有机培肥的响应

陈 阳，高 健，朱 平，高洪军，娄翼来，王义东

（1.天津师范大学 天津市水资源与水环境重点实验室，天津 300387；2.天津师范大学 地理与环境科学学院，天津 300387；3.吉林省农业科学院 农业资源与环境研究所，长春 130033；4.中国农业科学院 农业环境与可持续发展研究所，北京 100081）

土壤有机质（soil organic matter，SOM）是土壤质量的关键属性，在土壤肥力、生产力、生物多样性、可持续发展和气候变化等方面起着重要作用[1].目前，针对SOM的研究主要集中在数量方面，对其化学成分的认识还较为薄弱[1].SOM的化学成分主要包括脂肪族化合物、芳香族化合物、木质素、酚类化合物、多糖类化合物以及含氮化合物[2]，这些化合物成分是SOM发挥功能的基础，因此探讨SOM的化学成分特征变化具有重要意义[1-2].SOM的组分和结构复杂，存在高度异质性[3]，即不同组分的理化性质和周转稳定存在显著差异.物理分组是探究SOM化学成分变化的重要方法，包括密度分组、粒级分组和团聚体分组.相比于化学分组，物理分组对土壤的化学性质破坏性较小，能更好地保护有机质特性.Six等[4]提出的团聚体分组技术已被广泛应用于SOM的研究中.粒级分组能够有效地反映有机质的赋存状态和腐解程度，因为颗粒态组分（particulate organic matter，POM）和矿质结合组分（mineral-associated organic matter，MAOM）是通过特定过程形成的，具有不同的持久性和功能性[5].颗粒态组分主要包含未分解或半分解的动植物残体，其碳氮比（C/N）一般为10~40，易被微生物分解利用；而矿质结合组分是SOM分解较彻底且与土壤矿质相结合的部分，主要来自微生物残体，其C/N通常为8~13[6-7]，难被微生物进一步利用，因此表现出较强的稳定性和较长的滞留时间[8].颗粒态组分可以进一步分级为粗颗粒组分（coarse particulate organic matter，cPOM：>250μm）和细颗粒组分（fine particulate organic matter，f POM：53~250μm）[9].有机培肥是农业生产中一项重要的管理措施，长期有机培肥（有机肥施用、秸杆还田）会影响SOM的含量、元素组成和化学成分[10-13]，但如何影响SOM的粒级分异及化学特征尚不清楚，亟需深入研究.

黑土是我国宝贵的高肥力土壤资源，本课题组借助东北黑土长期定位实验，基于粒级分组，利用元素分析仪和热裂解-气相色谱/质谱技术（Py-GC/MS）研究有机培肥对SOM粒级分异和化学特征的影响.假设：①相比于有机培肥，粒级主要调控着SOM的碳、氮组成和化学成分特征，因为不同粒级往往表征着SOM的不同腐解程度；②秸秆还田和有机肥施用对SOM的碳、氮组成和化学成分具有不同的影响，因为二者在底物质量上差异明显.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

公主岭黑土长期施肥试验地位于吉林省公主岭的国家黑土肥力和肥料效益长期定位实验基地（43°30′23″N，124°48′34″E），属温带大陆性季风气候，年平均气温5.6℃，年降水量450~600 mm，年蒸发量1 200~1 600 mm.全年无霜期为144 d，每年日照时间约为2 330 h.该区土壤母质为第四纪黄土状沉积物，属于黑土土类黑土亚类肥黑土土种.田间耕作方式为玉米连作或者玉米-大豆轮作，一年一熟，且为雨养农业，常规操作.

初始耕层土壤性质：pH值为7.6、土壤有机碳（SOC）13.23 g/kg、总氮（TN）1.4 g/kg、总磷（TP）1.39 g/kg、总钾（TK）22.1 g/kg、碱解氮114 mg/kg、速效磷27 mg/kg、速效钾190 mg/kg.

1.2 实验设计与样品采集

实验开始于1990年，共设置12种实验处理，本研究选取其中3种处理：施加氮肥+磷肥+钾肥（NPK—单施化肥）、NPK+秸秆（NPKS—秸秆还田）、NPK+猪粪（NPKM—有机肥施用）.所施用的化肥量分别为：氮肥16.5 kg/hm2、磷肥82.5 kg/hm2、钾肥82.5 kg/hm2.有机肥猪粪作底肥，施用量为23 000 kg/hm2，1/3氮肥、磷肥和钾肥作口肥，而其余2/3氮肥于拔节前追施于表土下10 cm处.秸秆还田即将每季作物秸秆的一半还田，不考虑其养分.2017年秋收后，在每个小区内采用“S”型取样法随机选择5个点，使用螺旋钻采集取样点处0~20 cm深度的土壤，均匀混合成一个样品后装入自封袋中，编号并密封，每种处理重复取样3次.将样品带回实验室，去除杂质（如动植物残基、砾石等），在室温下风干，过2 mm筛后保存备用.

1.3 土壤有机质粒级分组

参照文献[4，13]的改良方法，用湿筛法分离土壤的3个粒级（cPOM：>250μm，fPOM：53~250μm，MAOM：<53μm）.具体操作方法为：称取土壤样品25 g，置于100 mL塑料瓶中，加入25颗玻璃珠（直径4 mm），60 mL超纯水，将塑料瓶置于振荡器上，在180 r/min转速下振荡1 h（25℃），之后将土样混合液用250μm的筛网筛分，用超纯水冲洗筛上部分至流下的水澄清.将筛上残留部分收集至铝盒中，在60℃下烘干至恒重，得到粗颗粒组分.将筛下部分物质用超纯水冲洗到大铝盒中，在60℃条件下烘干至恒重，之后将土样转移至100 mL塑料瓶内，加入60 mL六偏磷酸钠溶液（5 g/L）和25颗玻璃珠，将塑料瓶置于振荡器上，在180 r/min转速下振荡18 h（25℃）.振荡完成后将塑料瓶中土样混合液用53μm的筛网筛分，用超纯水冲洗筛上部分至流下的水澄清，将筛上和筛下部分分别转移到铝盒中，在60℃下烘干至恒重.筛上部分为细颗粒组分，筛下部分为矿质结合组分.冷却后，对3部分样品分别进行称重，将土壤样品研磨并通过100目的土壤筛，留存备用.

1.4 样品分析与测试

利用元素分析仪（PerkinElmer 2400Ⅱ，美国）测定全土与各粒级组分中SOC和TN的含量，C/N为SOC和TN含量的比值.利用双击式裂解器（PY-2020iD，Frontier Laboratories Ltd，日本）与联用的QP2010气相色谱-质谱仪（GC/MS，QP-2010Ultra，日本）对样品进行化学成分测定.取5 mg充分研磨后的土样置于白金小舟中，以自由落体方式将样品投入到石英裂解管中（裂解温度550℃）.裂解结束后，将化合物转入气相色谱仪（界面温度为300℃）.实验采用DB-5型色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，Frontier Laboratories Ltd，日本），分流进样比为100∶1（载气为He，流速为0.8 mL/min）.升温顺序为：初始温度为40℃，保持3 min，然后以10℃/min的速率升至260℃后，再以15°C/min的速率升至300℃，保持5 min.质谱条件采用电子轰击离子源（EI）模式，电子能量为70 eV，接口温度为300℃，全扫描模式，质荷比（m/z）的扫描范围为29~500.参照国家标准与技术研究所（NIST）化合物数据库（2011版）、已发布的光谱标准和实际标准，采用归一化法计算峰面积，从而对热裂解产物进行分析鉴定.共鉴定出了332种化学成分，根据化学结构和相似性分析分为10组[14-15]：脂肪族化合物、单环芳香烃、多环芳香烃、木质素、酚类化合物、多糖、氨基酸氮、杂环氮、其他含氮化合物和其他化合物.热裂解过程中，氨基酸氮易转化为常见的腈、吲哚、咪唑、吡咯、吡啶、吡嗪[15]，因此将这6种含氨基氮的化合物组合在一起，以减少分类误差.其他化合物包括含有卤素原子（Br、I、Cl）的化合物和具有更复杂分子结构的化合物.

所有热裂解化合物分为3种来源：植物来源、微生物来源和多重来源（植物+微生物）[16].长链脂质（>18个C原子）、木质素、酚类化合物、多糖、氨基酸氮（吲哚类）和杂环氮（嗪类）主要归为植物来源；短链脂质（<16个C原子）、芳香族化合物、氨基酸氮（吡咯、吡啶、腈）和其他含氮化合物被归为微生物来源；而一些脂类（16~18个C原子）和其他化合物归为多重来源化合物[14-16].

1.5 数据分析

采用单因素方差分析（one-way ANOVA）中的Tukey多重比较和对应分析检验不同施肥处理以及不同粒级组分下物质间的差异性（P<0.05）.用SPSS 26进行方差分析和对应分析，用Origin 2018进行绘图.

2 结果

2.1 不同粒级土壤有机质质量占比特征

不同施肥条件下不同粒级土壤有机质质量占比特征如图1所示.

图1 不同施肥条件下不同粒级土壤有机质质量占比特征Fig.1 Mass distribution of the different particle size classes under different fertilization regimes

土壤各粒级组分的质量占比特征为：矿质结合组分（>80%）>粗颗粒组分（7%~9%）>细颗粒组分（6%~7%），矿质结合组分的质量占比显著高于粗颗粒组分和细颗粒组分的质量占比（P<0.05）.有机肥施用使细颗粒组分质量占比提高了19.7%，使矿质结合组分质量占比降低了4.1%；秸秆还田对不同粒级土壤组分无显著影响.

2.2 不同粒级土壤有机质的碳氮含量与碳氮比

不同粒级土壤中有机碳和总氮的含量以及碳氮比如图2所示.

图2 土壤有机碳和总氮的含量以及碳氮比在全土和不同粒级组分中的分布Fig.2 Pools of SOC and TN content，and C/N ratio in the bulk soil and different particle size classes

经过27 a的实验，与单施化肥相比，秸秆还田、有机肥施用分别使全土中SOC含量提高了19%和65%，矿质结合组分中SOC含量最高，与颗粒态组分中SOC含量的差异具有统计学意义.有机肥施用使粗颗粒、细颗粒、矿质结合组分的SOC含量分别提升了162%、174%、40%（图2（a））.对于TN而言，秸秆还田和有机肥施用分别使全土中TN的含量显著提升了92%和96%.各个粒级组分TN含量与SOC含量的变化趋势一致，矿质结合组分中TN的含量远超过其他两种组分中的含量.添加秸秆未改变颗粒态组分的TN含量，但使矿质结合组分中TN的含量显著提升98%；有机肥的添加使粗颗粒组分、细颗粒组分、矿质结合组分的TN含量分别提升244%、302%和77%（图2（b））.秸秆还田显著降低了全土中的C/N，约降低38%.同一施肥方式下C/N随着粒级的减小呈现出降低的趋势，颗粒态有机质的C/N显著高于矿质结合组分的C/N.秸秆还田和有机肥施用均使得各个颗粒组分的C/N降低约13%~40%（图2（c））.

2.3 不同粒级土壤有机质组分化学特征

不同粒级土壤中有机质组分的化学成分也有所不同，成分及分析如图3和图4所示.

图3 土壤有机质化学成分Fig.3 Chemical composition of soil organic matter

颗粒态组分主要富集脂肪族化合物、单环芳香烃、酚类化合物和多糖，其中，细颗粒组分的脂肪族化合物和单环芳香烃相对丰度分别比矿质结合组分高出20%和25%，而矿质结合组分主要富集含氮化合物，相对丰度占比超过75%.与单施化肥相比，有机肥施用使全土中木质素和酚类化合物的相对丰度分别提高了174%和58%，秸秆还田使全土中酚类化合物相对丰度增加了129%.有机肥施用使粗颗粒组分中氨基酸氮的相对丰度降低了49%，细颗粒组分中脂肪族化合物的相对丰度降低了37%，矿质结合组分中多环芳香烃的相对丰度降低92%，但细颗粒中的木质素和多糖相对丰度分别提升了1 188%和23%.秸秆还田几乎未对各粒级土壤化学组成产生显著影响.由图4可知，以维度1原点为界，矿质结合组分分布在左侧，而颗粒态组分主要分布在右侧；多环芳香烃、含氮化合物和其他化合物富集在左侧，脂肪族化合物、单环芳香烃、木质素、酚类化合物和多糖富集在右侧，表明化学成分存在明显的粒级分异.

图4 土壤有机质化学成分（相对丰度）对应分析Fig.4 Correspondence analysis of the chemical composition（relative abundance）of soil organic matter

2.4 不同粒级土壤有机质来源分析

不同粒级土壤有机质来源也有所不同，如图5和图6所示.植物来源化合物在粗颗粒和细颗粒中相对富集，相对丰度达到20%~45%；而在矿质结合组分中，微生物来源化合物相对富集，相对丰度达到55%~72%.全土中植物来源化合物约占17%~20%，微生物来源占56%~70%，不同施肥方式对化合物来源的影响不大.但添加有机肥料后，矿质结合组分中植物来源化合物为13%~20%，显著低于其他2个组分（P<0.05）.秸秆还田和有机肥施用使细颗粒的植物来源化合物分别增加了76%和91%，微生物来源化合物均减少了约20%，多重来源化合物分别减少了47%和82%.由图6可知，以维度1原点为界，矿质结合组分主要分布在左侧，而颗粒态组分主要分布在右侧；多重来源化合物富集在左侧，植物来源化合物富集在右侧，而微生物来源化合物处于中间位置，表明有机质来源存在粒级分异，但分异较小.

图5 土壤有机质来源Fig.5 Sources of soil organic matter

图6 土壤有机质来源（相对丰度）对应分析Fig.6 Correspondence analysis of sources（relative abundance）of soil organic matter

3 讨论与结论

3.1 不同粒级土壤有机碳、总氮含量和C/N对长期有机培肥的响应

本研究显示，长期不同施肥条件下，黑土中矿质结合组分质量占比均最大（>80%），显著高于其他2个组分.大部分SOC和TN集中在矿质结合组分中，主要是由于矿质结合组分在农业用地土壤中所占比例很高[5-6，9]，周转速率慢，有利于SOC和TN的稳定与固存[17]，进而更能被微生物持续性利用，这支持了前文第一个假设.SOM结构复杂，能够对不同的施肥处理方式迅速响应，从而改变土壤的理化性质[18].就有机培肥而言，有机肥施用提升了粗颗粒组分和细颗粒组分的质量占比，降低了矿质结合组分的质量占比，且细颗粒组分和矿质结合组分受有机肥施用处理影响显著，这与以往的研究结果类似.因此，长期施用有机肥会增加作物生物量（地上部分和地下根系）和根系代谢产物，促进新鲜有机质的输入，从而促进小粒级组分向大粒级组分胶结[19].秸秆还田没有显著增加SOC的含量，可能是因为秸秆还田量以及还田年限的限制[12].2种有机培肥处理均显著增加了全土和各个粒级组分中TN的含量.

SOC和TN的变化使得粗颗粒组分和细颗粒组分具有较高的C/N，而矿质结合组分的C/N最低，这与粗颗粒组分和细颗粒组分中植物来源化合物较多的结果相符.此外，有机物肥料的添加可使C/N降低，而C/N越低，表明有机质的腐解程度越高.对此提出2个解释：①POM部分受到团聚体的保护[9]，因此分解程度低；②随着秸秆还田和有机肥施用的投入，土壤中微生物活动及其代谢作用增强，有足够的氮来进行消耗，而同化同质量的氮需要消耗更多的碳，从而反作用于土壤的C/N[20].

3.2 不同粒级土壤有机质化学组成对长期有机培肥的响应

相比于矿质结合组分，粗颗粒组分和细颗粒组分可富集更多的脂肪族化合物、单环芳香烃、木质素、酚类化合物和多糖[21-22].POM组分选择性地保留了具有顽固性特点的植物来源化合物，以实现短期的持久性运转，尽管长期以来，物理保护是这些物质长期留存的主要原因[7，23].另外，部分细颗粒组分可能被微团聚体封闭[12]，保留芳香族化合物和木质素.而矿质结合组分中含氮化合物的相对丰度很高[7]，这也表明了它积累了许多微生物残体[7，15]，它们很容易被黏土矿物吸附，形成有机质矿物结合体，从而增加这些矿质结合组分在土壤中的贮存时间[2，24].基于单因素方差分析，发现SOM的化学成分主要在粒级方面产生分异，这支持了第一个假设.但本研究结果也再次表明，细颗粒组分并不是3种粒级组分的过渡部分，这可能归因于：①与沙粒相关的有机质向粗颗粒组分偏移；②微团聚体对细颗粒组分有物理保护[9].

全土中，有机培肥主要影响的是木质素和酚类化合物的含量.对各个粒级组分主要影响为：粗颗粒组分中氨基酸氮减少；细颗粒组分中脂肪族化合物减少，木质素和多糖增多；矿质结合组分中多环芳香族化合物减少.由于木质素类化合物和多糖类化合物是由植物残体（细胞壁）衍生而来，其中部分产物在动物消化和微生物代谢中得以保留[25]，这可以解释在有机培肥作用下，细颗粒组分中这些物质相对增加，这一结论也支持了第二个假设，微团聚体对细颗粒组分的物理保护为这一结果做出了进一步解释[9].但是与单施化肥相比，粗颗粒组分的氨基酸氮随着有机肥施用而减少，这可能与含氮物质被利用有关.而在全土以及其他2个组分中，含氮化合物的相对丰度几乎不受施肥条件的影响，因为这些含氮化合物主要来自微生物，从而促成了其稳定的来源[14-16].

微生物来源的化合物对SOM的总体贡献率为55%~70%，这与以往的研究结果类似[16].本研究显示，矿质结合组分中植物来源化合物降低，微生物来源相应增加，木质素和多糖含量的降低也直接造成了这一结果.含氮化合物以氨基酸氮为主，其主要来源为微生物，有研究表明微生物来源的化合物能够稳定在土壤矿物表面[14]，这也印证了本研究的结果.SOM的稳定性和周转速率取决于其分子的化学组成特征[26]，但是在添加有机肥后，除细颗粒组分的化合物中植物来源增多以及微生物和多重来源减少外，全土和其他2个组分并未对来源组成做出响应.

4 结论

本研究以东北黑土长期有机培肥为研究平台，研究了不同粒级土壤有机质的碳、氮含量和化学组成特征，结论如下：

（1）各粒级组分中，矿质结合组分质量占比最大，且主导着SOC、TN库.秸秆还田增加了TN的含量，而有机肥施用增加了SOC和TN含量.

（2）有机培肥后颗粒态组分中脂肪族化合物、芳香族化合物、木质素、酚类化合物和多糖相对丰度增加.矿质结合组分中含氮化合物，特别是氨基酸氮相对丰度增加.有机培肥后矿质结合组分的化学组成变化小，表明该部分的SOM化学特征比较稳定.SOM的来源组成在粒级间变化不明显，但2种有机培肥均改变了细颗粒SOM的来源.

综上，粒级组分主要调控着SOM的含量与元素组成、化合物组成特征，而有机培肥的影响相对较小.