增温和增氮对天津滨海湿地芦苇凋落物分解微生物群落组成和多样性的影响

王丽霞，郭宏宇，霍玉珠，庞金玲，王欢欢，马成仓，王银华

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

气候变暖是当前全球变化的重要方面，生态系统对全球变暖的响应已成为生态学研究热点之一.氮素是生态系统中的重要营养元素，近年来由于人为活动导致的氮排放急剧增加，对生态系统的结构、功能及稳定性造成了不同程度的负面影响，关于氮输入增加对生态系统的影响也成为生态学研究前沿问题之一[1].滨海湿地是位于陆地和海洋间的独特生态系统，在净化水体、涵养水源、保持生物多样性和区域生态平衡方面发挥着重要作用[2].在全球变暖的背景下，滨海湿地面临着温度升高带来的挑战[3]，同时由于近年来大量的人为氮排放，滨海湿地氮污染问题也日趋严峻[4].有研究表明，贯穿京津地区的海河水系氮输入量达13.3 g/（m2·a），存在严重的氮污染情况[5].在滨海湿地生态系统中，微生物驱动的凋落物分解是生态系统物质循环和能量转换的重要环节[6].

本研究通过模拟增温和增氮控制交互实验，分析天津滨海湿地芦苇凋落物可培养细菌和真菌群落的组成及多样性在不同增温和增氮条件下的差异，揭示滨海湿地凋落物分解微生物群落在气候变暖和氮输入急剧增加背景下的响应模式，为合理利用滨海湿地微生物资源，有效保护和恢复滨海湿地生态系统提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

2019年10月，在天津滨海湿地采集原状土壤，从环境条件一致的典型芦苇湿地（38°41′N，117°23′E）中，用环刀采样器采集土样（0~20 cm）.共采集土样18份，分别放置于18个栽培盆中（直径15 cm，高20 cm，底部有透水孔），带回天津师范大学种植园.在同一芦苇湿地采集当年芦苇叶片凋落物，共18份，风干至恒重（约20 d）.将每份样品剪成1 cm×4 cm的条形并混匀，称取5 g样品装入尼龙网袋中（网孔大小为1 mm×1 mm），每个栽培盆土壤表面中央放置1个装有叶片凋落物样品的尼龙袋（使样品紧贴土壤表面）.

1.2 实验设置

2019年11月1日开始进行模拟增温和增氮交互实验.模拟增温实验设置为常温（AT）和增温（WT）处理.常温处理中，栽培盆放置于透明的避雨大棚中，保持良好通风，棚内温度与环境温度保持一致，实验期间平均温度为11.2℃.增温处理中，栽培盆放置于透明的增温温室中，利用温室效应进行增温，室内温度较常温处理平均增温2.3℃，实验期间平均温度为13.5℃.氮输入水平分别设置为：13（N13）、20（N20）、40（N40）g/（m2·a）.共6个处理组合：AT×N13（A）、AT×N20（B）、AT×N40（C）、WT×N13（D）、WT×N20（E）、WT×N40（F）.将18盆土样和芦苇叶片凋落物样品随机分配到以上6个处理组合中，每个组合3个重复.实验过程中，将栽培盆置于适当大小的水盆中（维持水深约3 cm），栽培盆中土壤通过透水孔吸收水分以保持稳定的水的质量分数（约30%，与天津滨海湿地土壤中水的质量分数基本相当）.根据氮输入水平设置，每月在N13、N20和N40处理中的各栽培盆土壤表面均匀施加适量尿素.2020年6月30日，采集芦苇叶片凋落物样品，-20℃条件下保存.

1.3 实验方法

1.3.1 土壤理化性质分析

采用烘干称重法测定土壤中水的质量分数（SWC），采用酸度计法测定土壤pH值（土与水的质量比为1∶1），采用燃烧法测定土壤有机质含量（SOM），采用盐度计法测定土壤盐度（S），采用紫外分光光度法测定土壤总氮含量（TN）和硝态氮含量（NO3-），采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定土壤亚硝态氮含量（NO2-），采用靛酚蓝比色法测定土壤铵态氮含量（NH4+），采用碱熔-钼锑抗分光光度法测定土壤总磷含量（TP），采用钼酸铵分光光度法测定土壤有效磷含量（AP）.

1.3.2 芦苇凋落物分解细菌和真菌的分离与鉴定

采用经典稀释涂布平板法，分析芦苇凋落物中可培养细菌和真菌的群落组成.用牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌，37℃条件下培养2~3 d；用孟加拉红培养基培养真菌，28℃条件下培养3~5 d.通过预实验确定适宜的稀释倍数，使平板上菌落数量约为30~300个.对稀释后的菌液进行涂布，用菌落计数器对不同形态的菌落进行计数，用平板划线法将不同形态的菌落纯化为单一形态的菌落.分别利用细菌和真菌基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取细菌和真菌的基因组DNA，以其为模板对特定片段进行PCR扩增.利用引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）扩增细菌16S rRNA基因片段，利用引物Geo A2（5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和Geo11（5′-ACCTTGTTACTTTTACTTCC-3′）扩增真菌18S rRNA基因片段，产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，用BLAST程序（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对测序结果进行比对分析，鉴定到属分类学水平.

1.4 数据处理

根据不同处理组中细菌和真菌的群落组成数据，分别计算细菌和真菌群落的Shannon-Wiener多样性指数（H）和Simpson多样性指数（D），公式如下：

式中：Pi表示群落中第i个物种的个体数占群落中个体总数的比例.

应用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析和Tukey HSD多重比较分析，用Origin Pro 2017软件作图.应用PAST 3软件对微生物群落组成特征进行非度量多维尺度分析（NMDS）.应用Canoco 5软件对微生物群落组成和土壤理化因子间相关关系进行冗余分析（RDA）.

2 结果与分析

2.1 不同温度和氮输入水平条件下土壤理化性质差异

不同温度和氮输入水平条件下，天津滨海湿地土壤的主要理化性质如表1所示.

表1 不同增温和增氮条件下天津滨海湿地土壤主要理化性质Tab.1 Main properties of soil in Tianjin coastal wetland under different temperatures and nitrogen input levels

由表1可以看出，不同处理组中，土壤中水的质量分数和盐度均差异均不具有统计学意义（P>0.05），表明增温和增氮对二者没有显著影响.随着氮输入水平的增加，pH值呈下降趋势，土壤有机质含量、总氮含量、铵态氮含量、硝态氮含量、亚硝态氮含量、总磷含量、有效磷含量均呈上升趋势.随着温度增加，土壤有机质含量呈下降趋势，铵态氮含量呈上升趋势.

2.2 芦苇凋落物可培养细菌和真菌的数量差异

在不同温度和氮输入水平条件下，天津滨海湿地芦苇凋落物可培养细菌和真菌数量如图1所示.

图1 不同温度和氮输入水平条件下芦苇凋落物可培养细菌和真菌数量Fig.1 Quantities of culturable bacteria and fungi of P.australis litter under different temperatures and nitrogen input levels

由图1（a）可以看出，相同氮输入水平条件下，增温处理使细菌数量呈下降趋势；相同温度条件下，随着氮输入水平增加细菌数量呈先下降再上升的趋势.由图1（b）可以看出，随着氮输入水平的增加真菌数量呈先上升再下降的趋势.

2.3 芦苇凋落物可培养细菌和真菌的群落组成差异在天津滨海湿地芦苇凋落物中分离得到可培养细

菌18个属和真菌17个属，群落组成如图2所示.

图2 不同温度和氮输入水平条件下细菌和真菌群落组成Fig.2 Community composition of culturable bacteria and fungi under different temperatures and nitrogen input levels

由图2（a）可以看出，AT-N40处理组中细菌的菌属丰富度最高（有15个属），AT-N20处理组中菌属丰富度最低（有8个属）.不同温度和氮输入水平处理中均分布有芽孢杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、考克氏菌属（Kocuria）、放线菌属（Actinomycetes）和动性球菌属（Planococcus）.芽孢杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和节杆菌属在各处理组中均占有较高比例；而短双歧杆菌属（Bifidobacterium）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）仅出现在常温处理中.由图2（b）可以看出，WT-N13处理组中真菌的菌属丰富度最高（有15个属），WT-N20和WT-N40处理组中均有10个属.在不同温度和氮输入水平处理中均分布有曲霉属（Aspergillus）、多环孢霉属（Ciclosporin）、木霉属（Trichoderma）、顶头孢属（Cephalosporium）、青霉属（Penicillium）、蓝状菌属（Talaromyces）.红孢菌属（Catenulispora）和小不整球壳属（Plectosphaerella）仅出现在常温处理中；玛丽亚霉属（Mariannaea）仅出现在增温处理中.

对不同温度和氮输入水平条件下芦苇凋落物可培养细菌和真菌的群落组成进行NMDS分析，结果如图3所示.

图3 不同温度和氮输入水平条件下细菌和真菌群落组成的非度量多维尺度分析（NMDS，基于Bray-Curtis相异系数）Fig.3 Nonmetric multidimensional scaling analysis of bacteria and fungi community composition of under different temperatures and nitrogen input levels（NMDS，Based on Bray-Curtis dissimilarity）

由图3可以看出，不同温度和氮输入水平处理间细菌群落和真菌群落的组成均存在明显差异，表明增温和增氮对芦苇凋落物可培养细菌群落和真菌群落组成均有显著影响.

2.4 芦苇凋落物可培养细菌和真菌的群落多样性差异不同温度和氮输入水平条件下芦苇凋落物可培

养细菌和真菌的群落多样性如图4所示.由图4（a）和图4（b）可以看出，氮输入水平为13 g/（m2·a）条件下，与常温处理相比，增温处理使细菌群落H指数和D指数均显著上升（P<0.05）；氮输入水平为20 g/（m2·a）条件下，常温和增温处理间细菌群落H指数和D指数差异不显著（P>0.05）；氮输入水平为40 g/（m2·a）条件下，增温处理使细菌群落H指数和D指数显著下降（P<0.05）.常温处理条件下，细菌群落H指数和D指数均随氮输入水平增加而上升；增温处理条件下，细菌群落H和D指数均随氮输入水平增加而下降.

由图4（c）和图4（d）可以看出，与常温处理相比，增温处理使真菌群落H指数和D指数呈下降趋势.真菌群落H指数和D指数均随氮输入水平增加而下降.

图4 不同温度和氮输入水平条件下细菌与真菌群落Shannon-Wiener和Simpson多样性指数Fig.4 Community Shannon-Wiener diversity and Simpson diversity of bacterial and fungal communities under different temperatures and nitrogen input levels

2.5 芦苇凋落物可培养细菌和真菌群落组成与土壤理化性质间的相关关系

不同温度和氮输入水平条件下，芦苇凋落物可培养细菌和真菌群落组成与土壤理化性质间相关关系的冗余分析（RDA）结果如图5所示，各土壤因子对细菌群落和真菌群落组成变异的解释度如表2所示.

由图5（a）可知，前2个RDA轴的特征值分别为0.388 2和0.129 1，对芦苇凋落物可培养细菌群落组成变异的总解释度为51.73%.微杆菌属（Microbacterium）、鞘氨杆菌属（Sphingomonas）、溶杆菌属（Fusobacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）和葡萄球菌属与土壤盐度、有效磷含量、硝态氮含量、铵态氮含量呈正相关关系；不动杆菌属、芽孢杆菌属和节杆菌属与土壤总磷含量呈正相关关系；诺卡氏菌属（Nocardia）、红球菌属（Rhodococcus）、链球菌属、假单胞菌属、类芽孢杆菌属和放线菌属与土壤pH值呈正相关关系；动性球菌属（Planococcus）、考克氏菌属、伯克氏菌属（Burkholderia）和短双歧杆菌属与土壤有机质含量、亚硝态氮含量、土壤中水的质量分数和总氮含量呈正相关关系.由表2可知，总体上对芦苇凋落物可培养细菌群落组成起主导作用的土壤因子为土壤总磷含量（解释度16.40%）、亚硝态氮含量（解释度14.10%）和铵态氮含量（解释度12.70%）.

由图5（b）可知，前2个RDA轴的特征值分别为0.615 8和0.019 9，对芦苇凋落物可培养真菌群落组成变异的总解释度为63.58%.顶头孢属和链孢霉属（Neurospora）与土壤中水的质量分数和盐度呈正相关关系；交链孢属（Alternaria）、玛丽亚霉属和曲霉属与土壤有效磷含量、硝态氮含量、有机质含量和总氮含量呈正相关关系；多环孢霉属、镰刀菌属（Fusarium）、青霉属、帚枝霉属（Sarocladium）、拟青霉属（Paecilomyces）、毛霉属（Mucor）和赤霉属（Gibberella）与土壤pH值呈正相关关系；枝孢霉属（Ramulispora）、小不整球壳属、红孢菌属、蓝状菌属和木霉属与土壤总磷、铵态氮、亚硝态氮含量呈正相关关系.由表2可知，对芦苇凋落物可培养真菌群落组成起主导作用的土壤因子为土壤亚硝态氮含量（解释度16.70%）和pH值（解释度12.40%）.

图5 不同温度和氮输入水平条件下细菌和真菌群落组成与土壤理化性质间相关关系的冗余分析（RDA）Fig.5 Redundancy analysis（RDA）of the relationships between the bacterial and fungal community compositions and the main soil properties under different temperatures and nitrogen input levels

表2 冗余分析中各土壤因子对不同温度和氮输入水平条件下细菌和真菌群落组成变异的解释度Tab.2 Explaining percentage of soil factors for the variations in the bacterial and fungal community compositions under different temperatures and nitrogen input levels in the redundancy analysis（RDA）

3 讨论与结论

本研究通过模拟增温和增氮控制交互实验，探究增温和增氮对天津滨海湿地芦苇凋落物可培养细菌和真菌群落的影响.结果表明，增温使细菌数量降低，可能是由于凋落物中细菌对增温较为敏感.宋影等[7]、庞芳[8]的研究均表明，增温可显著抑制细菌数量.本研究中增温对芦苇凋落物可培养真菌数量无显著影响，表明这些真菌类群可能对增温有较强的耐受能力.这与谭成玉[9]、刘丽等[10]的研究结果一致.

总体上氮输入水平的增加可使芦苇凋落物可培养细菌数量降低，可能是因为增氮可引起土壤pH值降低，导致土壤酸化，从而使土壤的交换性Al3+含量升高，对细菌数量产生抑制作用[11].周世兴等[12]研究发现，在森林生态系统中过量的外源氮输入显著降低了土壤细菌数量.本研究中芦苇凋落物可培养真菌数量随氮输入水平的增加呈先上升再下降的趋势，这表明较低的氮输入水平可促进真菌数量的增加，而较高的氮输入水平则会抑制真菌数量.这可能是由于中等氮输入水平可促进土壤氮磷等营养物质的循环，为土壤真菌的生长提供了良好的条件；而较高的氮输入水平可导致土壤酸化，增加Ca2+、Mg2+等阳离子的溶解与流失，土壤溶液中Al3+浓度增加，对真菌产生毒害作用[13].付智丹等[14]研究发现，适宜的施氮量可增加农田土壤中的真菌数量.周世兴等[12]研究发现，过量的外源氮输入对土壤真菌数量有显著抑制作用.此外，有研究指出，土壤中外源氮输入水平超过一定阈值后，土壤微生物群落由真菌占优势逐渐转变为细菌占优势[15-16]，这也可能是本研究中在较高氮输入水平条件下芦苇凋落物可培

养真菌数量下降而细菌数量上升的原因.常温条件下芦苇凋落物可培养细菌多样性指数随氮输入水平增加而上升，增温条件下指数随氮输入水平增加而下降.Sun等[17]的研究表明，适量施氮可增加土壤细菌群落多样性，过量施氮则使土壤细菌群落多样性下降.Jennifer等[18]的研究表明，高氮沉降区土壤细菌群落多样性较低.本研究进一步发现，增温将强化较高氮输入水平对细菌群落多样性的负面影响.增温处理使芦苇凋落物可培养真菌群落的多样性指数下降，可能是由于在增温条件下，能耐受较高温度的真菌类群更占优势（如木霉菌属、玛丽亚霉属），从而使真菌群落多样性有所降低.这一结果与姚世庭[19]、Asma等[20]的研究结果一致.本研究中芦苇凋落物真菌群落多样性指数随氮输入水平的增加而下降，这可能是由于氮输入的增加使土壤pH值下降，导致土壤酸化，从而使真菌多样性降低[21].Yu等[22]、王春萍等[23]的研究也表明，增氮可使土壤真菌多样性降低.此外，在较高氮输入水平条件下，凋落物中可分泌抗生素的真菌类群（如木霉属和青霉属）的相对丰度有所增加，这也可能使对抗生素敏感的真菌类群受到抑制[24]，从而导致真菌群落多样性下降.本研究表明，滨海湿地中凋落物分解真菌群落与土壤真菌群落对氮输入水平的增加有相似的响应模式.

对芦苇凋落物可培养细菌群落组成起主导作用的土壤因子为土壤总磷含量、亚硝态氮含量和铵态氮含量，对真菌群落组成起主导作用的土壤因子为土壤亚硝态氮含量和pH值.已有研究指出，亚硝态氮含量对土壤细菌和真菌群落组成均有重要影响[24-25].刘金良[26]的研究也表明，土壤磷含量可显著影响植物根际细菌群落的结构和组成；刘红梅[27]的研究显示，pH值的改变可引起草原土壤真菌群落组成的显著变化.本研究结果表明，增温和增氮可改变滨海湿地土壤的理化性质，进而影响凋落物分解微生物群落的组成特征.

综上所述，全球变暖和氮输入水平的急剧增加将改变滨海湿地芦苇凋落物分解微生物的群落组成，并降低其群落多样性，这将导致滨海湿地凋落物分解微生物功能的降低，进而对滨海湿地物质循环产生不利影响.