对虾白斑综合征病毒快速检测技术研究进展

马超 杨莉莉 郑秋月 郑文杰 曹际娟*

（1.大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室 辽宁 大连 116600；2.天津师范大学）

1 前言

对虾白斑病（White Spot Disease，WSD），是由对虾白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）引发的一种严重综合性传染性疾病[1]。WSSV属线头毒科目 （Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus），是一种快速复制、毒性极强的虾病原体，已在全球出现并成为最普遍和广泛的病毒之一[2]。由于其具有发病急、死亡率高、死亡速度快的特点，多年来一直严重威胁着全世界对虾的养殖安全。世界动物卫生组织（OIE）将其列为强制通报水生动物疫病，亚太地区水产养殖发展网络中心（NACA）将其列为强制通报疫病[3]，我国农业部在2008年将其列为一类动物疫病。

WSSV的形态和超微结构迄今为止尚未被完全了解。在显微镜下可观察到，WSSV病毒粒子从杆状到卵圆形椭圆状，带有3层囊膜，在一端有长包膜延伸，粒子尺寸范围较大（80 nm～120 nm×250 nm～380 nm）。病毒包膜有6～7 nm厚，病毒粒子为杆状，包含双链DNA[4]。WSSV病毒具有毒力强、发病急、复制速度快、传播力度强、致死率高等特点，患病的虾从出现症状至死亡只有3～5 d的时间，甚至更短[5]。感染WSSV的虾在外骨骼、附属物和表皮内会迅速出现大小不等的白色斑点（直径约0.5～3.0 mm），因此取名为白斑综合征。

2 流行现状

1921年，中国台湾首次发现WSD，之后蔓延至其他亚洲国家。美洲首例确诊的WSSV病例于1995年在美国德克萨斯州被发现[6]。此病的感染率较高，约7 d可使池中70%以上的虾被感染，甚至死亡。这种流行性病毒性疾病的爆发，给全球对虾养殖业造成了严重的经济损失[7]。此病毒可以通过水域大范围传播，传染性强，一旦水中有病虾，病虾的排泄物及其他身体组织会迅速扩散，将此范围的水域污染，同水域的所有正常对虾及其他虾类[8]，如小龙虾等都有可能受到感染[9]。人工感染实验证明，通过注射、投食、浸泡3种感染方式均能造成WSSV的感染。可见WSSV的感染性极强，因此对WSD的防治工作势在必行。

3 WSSV的基因组信息及主要结构蛋白

对WSSV的基因组及蛋白质的鉴定，有助于研究人员了解WSSV的装配形式和入侵机理。目前在GenBank公布的WSSV的基因组序列已有8株[10]。WSSV病毒的结构蛋白主要包括核衣壳蛋白、囊膜蛋白和被膜蛋白，病毒的非结构蛋白大多是一些催化、调节病毒复制的酶类和调控蛋白。目前已经鉴定的蛋白主要有核衣壳蛋白VP15[11]，在病毒粒子的囊膜蛋白中占比较高的VP19[12]蛋白，从纯化的WSSV中分离鉴定而得到一种结构蛋白VP24[13]。还有作为粘附蛋白的VP26[14]，此蛋白能够将病毒粘附于宿主细胞上，从而帮助病毒感染宿主，且VP26在病毒粒子中与其它结构蛋白相比含量较高。囊膜相关蛋白VP28[15-16]也是非常重要的，它能够在脱离病毒状态下，单独和宿主细胞发生结合。除此之外，还有在WSSV感染宿主时能够起到一定中和作用的VP31[17]囊膜蛋白及VP32[18]、VP33[19-20]等WSSV病毒的结构蛋白。

4 WSSV的检测技术

目前，针对对虾暴发性流行病的病理学、病原学、诊断学及流行病学的研究已深入至分子水平。但由于WSSV具有细胞内寄生的特性，是通过水生途径传播且尚无有效药物，因此，到目前为止还不能完全控制WSSV的疫情。当前最主要的措施是及早发现和消灭传染源，果断切断传播途径，在对虾养殖过程中实施早期诊断和提前预防的策略，以建立完善准确、高效、灵敏、快捷、方便的检测方法。常用的检测技术主要包括组织病理学诊断技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术。

4.1 组织病理学诊断技术

组织病理学诊断是比较传统的检测方法，主要以染色组织病理学检测法为主，通过电子显微镜观察细胞核是否肿大和核内嗜酸两性着色病变来进行判断，比较直观。但该方法操作较为繁琐、灵敏度较低，且易受时间、实验设备和人员的限制，还可能出现漏检的情况，实用性较差，不宜应用于现场检测[21]。

4.2 免疫学检测技术

4.2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附技术（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是利用抗体分子能够与抗原分子特异性共价结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白相结合，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。该技术建立在抗原抗体反应上，能够应用于大批量检测，在发病前20余天就可以做出预测，对仪器的要求较低，在实际应用中具有广阔的前景。但是制备多克隆抗体或单克隆抗体的过程较为繁琐、历时较长，且容易被污染而产生假阳性[22]。

XIE X等[23]采用蛋白质组学技术鉴定了WSSV的58种结构蛋白，发现其中至少7种囊膜蛋白与病毒的侵染过程相关。

郑晓聪等[24]用纯化的表达蛋白VP28制备了单克隆抗体与多克隆抗体，成功建立了检测WSSV的双抗体夹心ELISA方法。优化后的ELISA法与早期检测技术相比，能够更大程度地保证检测的准确性。

Tang Xiaoqian等[25]对双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）定量检测WSSV进行优化。此研究中建立了WSSV对数浓度与OD值的标准曲线，得出在120～7 680 ng/mL范围内两者呈线性关系，定量测定了人工感染WSSV后螯虾不同组织中的病毒蛋白，可检测感染小龙虾从感染初期至死亡阶段的WSSV传播情况，为WSSV的诊断提供了参考。

4.2.2 胶体金试纸法

胶体金试纸法是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。自1971年FAULK和TAYTOR将胶体金引入免疫化学，此方法在生物医学领域得到了广泛应用。该技术大多用单克隆抗体标记，具有很好的特异性，且阴阳性显色更明显，肉眼更容易判断[26]。

张玲等[27]通过复苏WSSV单克隆抗体杂交瘤细胞2E6、1G12、3B7、4G9和5D2，利用辛酸-硫酸铵法纯化腹水单抗。选择单抗2E6作为金标抗体，以柠檬酸钠还原法制备胶体金，通过胶体金标记单抗2E6制备金标抗体，整个过程仅需要10 min，且无需专业仪器设备，通过肉眼即可观察检测结果，对养殖现场的虾类、蟹类等甲壳类生物WSSV的半定量快速检测适用性较好，但对因操作不当等产生的假阳性问题还需进一步优化。

4.3 分子生物学检测技术

应用核酸探针进行斑点杂交法[28]和原位杂交法[29]对WSSV进行检测是早期在分子生物学领域较为常用的方法，但这类方法耗时长、操作繁琐，且可能存在非特异性标记，不适宜在基层使用。之后通过不断优化，该技术更加成熟，常用的分子生物学检测技术主要有套式PCR、荧光PCR、LAMP和RPA等。

4.3.1 套式PCR检测技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA双链复制的原理，在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊DNA复制[30]。1985年美国科学家穆利斯发明了PCR技术，并于1993年获得了诺贝尔奖。目前我国的国家标准是采用套式PCR检测技术[31]，套式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用2对PCR引物扩增完整的片段，以第1步PCR的扩增产物为模板，将第2对引物结合在第1步PCR产物的内部。该方法与一步PCR相比，灵敏性、特异性更高，但存在着操作繁琐、易交叉污染等问题。

李文杰等[32]根据GenBank中已发表的3株WSSV的VP28基因序列，建立了检测克氏原螯虾WSSV的套式PCR方法。该方法第1轮扩增的敏感性是36 ng，第2轮扩增的敏感性是36 pg，其灵敏度比一步PCR提高了1 000倍，具有更高的检测灵敏度和应用前景。但该方法也容易出现假阳性，常雯等[33]对套式PCR方法出现假阳性的原因进行分析并提出控制措施。

4.3.2 实时荧光定量PCR检测技术

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是指在DNA扩增反应中，在PCR反应体系中加入荧光基团，保证PCR反应时荧光信号的增加和PCR产物扩增的同步性，由于其在每轮循环时，都能检测1次荧光信号的强度，因此能够在实现监测荧光信号累积的同时，对PCR全程进行实时监测，并利用标准曲线，对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

Xian-Hong Meng等[34]采用TaqMan实时PCR法，对不同生长季节的南美白对虾的WSSV感染情况进行调查，初步发现，在虾群中病毒载量为103copies/ng时，会引发WSSV的爆发。

陈蒙蒙[35]针对凡纳滨对虾血细胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridescent Virus，SHIV）病原建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，其灵敏度能够达到4 copies SHIV/μL DNA，可以应用于临床采集对虾样品和人工感染对虾样品的检测。该方法检测灵敏度很高，对研究建立检测WSSV的实时荧光定量PCR技术具有借鉴和指导作用。

4.3.3 环介导等温扩增检测技术（LAMP）

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是指在等温（60℃～65℃）条件下，短时间（通常是1 h内）内进行核酸扩增的方法，和常规PCR相比，LAMP不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，是一种具有简单、快速、特异性强、适合现场、基层快速检测等特点的全新的核酸扩增方法[36]。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方面能媲美甚至优于PCR技术，且检测成本低于荧光定量PCR。

KONO等[37]于2004年首次应用LAMP技术检测WSSV，采用2组引物扩增WSSV基因组的235 bp靶标片段，检测灵敏度能够达到10 fg。

李红梅等[38]选取WSSV的囊膜蛋白VP28基因为靶标，利用ESE-Quant tube scanner检测平台建立了一套基于LAMP的实时荧光检测方法。结果显示，对于传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌O1和O139等5种病原DNA，该方法具有很好的WSSV检测特异性。与琼脂糖凝胶电泳检测法以及ZHU F等[39]建立的TaqMan实时荧光PCR等检测方法相比，具有相同的灵敏度，结果表明，在1.365×104～1.129×109copies/μL浓度范围内，可检测到WSSV拷贝数，105稀释组（1.524×105copies/μL）死亡率为60%。但在样品模板不纯的情况下，该方法可能会导致扩增曲线倾斜向上等假性结果现象。

张娜等[40]针对WSSV和IHHNV病毒建立了双重LAMP检测方法，采用荧光目测观察和电泳分析2种方法对结果进行判定，灵敏度结果显示，该方法的最低检测限为100 fg，荧光显色目测判定方法的最低检测限为1 pg，优于周国勤等[32]建立的套式PCR方法（36 pg）。但该方法无法将2种感染病毒加以区分，且荧光目测观察极易出现假阳性。

吴丽云等[41]利用钙黄绿素作为检测指示剂，建立了可视化LAMP快速检测WSSV的方法，最低检测限可达到0.225～2.250 copies/μL，此方法具有操作简便、检测快速、灵敏度高等优点，能够满足实际应用的需求，但是该方法的灵敏度是基于纯化的阳性质粒，而实际感染病毒样本的核酸存在着诸多抑制因子，可能会影响实际检测结果。

4.3.4 重组酶聚合酶扩增检测技术（RPA）

重组酶聚合酶扩增检测技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被 称 为 是 可 以 替 代PCR的核酸检测方法，其最大优势是可以在等温条件下进行扩增。与传统PCR相比，RPA引物碱基数更多，引物解链温度对扩增性能影响很小[42]。

夏小明等[43]选定Vp28作为WSSV检测重组质粒的靶标序列，利用RPA技术建立的检测方法的最低检测限约为2.250～0.225 copies/μL，具有较高特异性且无交叉反应，适用于养殖对虾的现场监测，但是该方法的稳定性有待于进一步优化。

Thawatchai等[44]将CRISPR-Cas12a荧光检测技术与快速核酸扩增相结合，对WSSV的Vp28质粒进行检测，研究中构建的RPA-Cas检测方法的最低检测限为200拷贝数/反应，且特异性较好，无交叉反应出现。该方法在恒温条件下即可进行，无需专用仪器，可通过便携式荧光分光光度计或暴露在紫外线下实现可视化，适用于现场监测。

5 结论

人类对甲壳类病毒的研究历史不长，目前约60年，特别是对养殖虾类的病毒病害研究历史更短。本文通过分析WSD的流行现状，主要介绍了WSSV检测技术的研究进展及其特点。分析发现，现有方法仍然会有因操作不当等因素出现特异性、灵敏度、易污染等问题，影响检测结果的准确性，因此需要建立更多检测方法以相互对比验证。水产养殖业的规模不断扩大，需要更适合现场操作、可视化的快速检测技术。今后对WSSV检测技术的研究依然是以分子生物学水平为主，借助多方快检技术相互验证、核酸提取与扩增一体化的微流控芯片检测技术、CRISPRCas12a基因编辑技术与核酸扩增相结合等技术或将成为适用于现场快速检测WSSV技术的重点发展方向。