抗病毒蛋白Viperin对细胞自噬相关蛋白的影响

魏玉婷，刘善虑，张 博，房家立，王 荃，苗春晖

（1.天津医科大学基础医学院，天津 300070；2.美国俄亥俄州立大学兽医学院，哥伦布 43210）

在病毒感染前期，人类的固有免疫应答是抵抗病毒感染的第一道防御[1].有研究[2-3]指出，在抵抗病毒感染过程中固有免疫应答可通过调控干扰素刺激基因ISG（包括ISG15、Tetherin、IFITM家族蛋白等）的表达，抑制病毒的入侵和复制.Viperin（virus inhibitory protein，endoplasmic reticulum-associated，interferon-inducible）是一种在固有免疫应答中由干扰素和病毒感染诱导产生的具有多种抗病毒功能的蛋白[4].人体中Viperin蛋白包含361个氨基酸，在结构上主要由N端两性的α螺旋结构域、中间SAM结构域和C末端结构域组成.N端结构域是Viperin蛋白与内质网及脂滴结合的关键位点[5]，序列在不同物种间差异较大；中间SAM结构域和C末端结构域在物种间非常保守，对Viperin蛋白的抗病毒活性同样具有重要作用[6].近年来，有研究[7-8]表明，Viperin在许多物种（包括禽类、鱼类、畜类等）中对病毒感染有强烈的抑制作用，但作用机制尚不明确.Lim等[9]研究发现，灵长类动物中Viperin参与物种进化中的正向选择，其变化位点可能与宿主和病毒间的相互作用密切相关.多项研究[10-12]指出，某些抗病毒蛋白在非人类灵长类动物中的表达活性与在人类中的表达活性不同，且更加有效，如抗病毒蛋白PKR、Tetherin、TRIM5α以及APOBEC3G等.

细胞自噬是人体自我抵御外源病原体感染的主要手段之一，该过程可利用多种细胞因子识别入侵病原体，形成包裹病原体的自噬泡，以融合溶酶体的方式使病原体在自噬溶酶体中降解[13-14].在以往研究中，本课题组观察到Viperin过表达的人肾脏上皮细胞HEK293中存在较多的囊泡，因此，推测Viperin可能对细胞自噬有调控作用，从而在固有免疫中发挥作用，并在物种进化中参与灵长类动物进化的正向选择.本研究在人肾脏上皮细胞HEK293和人非小细胞肺癌细胞A549中，利用过表达、免疫荧光、Western blotting等分子生物学技术，比较分析Viperin在多个物种中对自噬相关蛋白表达的影响，为病毒治疗的临床研究提供新靶点和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人肾脏上皮细胞HEK293、人非小细胞肺癌细胞A549，美国ATCC公司.

1.1.2 试剂

DMEM培养基和RPMI培养基，美国Gibco Invitrogen公司；胎牛血清和磷酸盐缓冲液，以色列Biolog-ical Industries公司；胰酶，加拿大MRC公司；RIPA裂解液，北京索莱宝科技有限公司；SDS上样缓冲液，北京康为世纪生物科技有限公司；xfect Transfection Reagent，北京TaKaRa公司；LC3B抗体、β-actin抗体和DAPI染料，美国Sigma-Aldrich公司；Beclin 1抗体和P62抗体，美国CST公司；mCherry-GFP-LC3质粒，淼灵质粒共享平台；多个物种的Viperin质粒，美国Michael Emerman实验室赠与.

1.1.3 仪器

1300 SERIES A2生物安全柜、FORMA Direct Heat CO2细胞培养箱、Nano Drop2000超微量分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific公司；Amersham Imager 600超敏多灵敏成像仪，英国GE公司；Leica TCS SP8共聚焦荧光显微镜，德国Leica Microsystems公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在DMEM基础培养基中培养HEK293细胞，在RPMI1640基础培养基中培养A549细胞，2种培养基中均添加10%的胎牛血清和100 U/mL青链霉素合剂，培养箱条件：5%CO2、37℃.

1.2.2 细胞质粒转染

将适量的HEK293细胞接种于24孔细胞培养板中，24 h后，更换为预热至37℃的无血清DMEM培养基.每孔细胞用PEI试剂转染0.5～1.0μg的Viperin质粒，1μg质粒的试剂用量为5μL.6 h后更换为含有胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h.在A549细胞中转染多种灵长类动物的Viperin，使用xfect polymer转染试剂，1μg质粒的试剂用量为0.3μL.

1.2.3 siRNA介导的胞内蛋白敲低

将适量的HEK293细胞接种于24孔细胞培养板中，24 h后更换为预热至37℃的无血清DMEM培养基.每孔细胞用Lipofectamin 3000试剂转染0.04 nmol siRNA，0.01 nmol siRNA的试剂用量为1μL，6 h后更换为含有胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h.

1.2.4 Western blotting检测

用PBS清洗细胞后弃掉上清液，加入RIPA裂解液，冰上放置20 min.在4℃下以12 000 r/min转速离心10 min，取上清液与SDS上样缓冲液混合，100℃水浴10 min.样品制成后，在恒压100 V条件下，于12%或15%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳2 h.然后用湿转法转于PVDF膜，恒压100 V保持1 h.转膜结束后，在室温下于5%脱脂奶/PBS中封闭1 h，然后加入相应的一抗在4℃条件下孵育过夜.过夜之后，用0.1%TBS-T缓冲液洗膜3次，室温下加入相应的二抗保持1 h，用0.1%TBST缓冲液洗膜3次后曝光.

1.2.5 免疫荧光观察LC3介导的自噬体形成

将适量HEK293细胞接种于4孔细胞培养小室中，24 h后更换为预热至37℃的无血清DMEM培养基.实验组细胞用PEI试剂共转染300 ng mCherry-GFP-LC3B和500 ng Viperin，对照组细胞用空载质粒转染.48 h后用4%的多聚甲醛固定细胞10 min，弃上清液后加入DAPI，在室温下避光孵育10 min进行染核，之后用PBS清洗，采用共聚焦荧光显微镜观察自噬体的形成.

1.2.6 数据分析

利用NIHImageJ software软件（美国National Institutes of Health）检测免疫印迹的条带灰度值，并且对自噬体进行计数.

1.3 统计学分析

利用Graphpad Prism 8.0.2软件进行统计学分析，数据以平均值±SD表示，采用Student’sttest或ANOVA方法计算组间差异：P＜0.05，*；P＜0.01，**；P＜0.001，***.

2 结果与分析

2.1 Viperin诱导细胞自噬蛋白LC3的脂化及P62的降解

在HEK293细胞中转染不同剂量的Viperin蛋白，48 h后细胞内自噬标志分子LC3与P62的表达情况如图1所示.由图1（a）可以看出，同对照组（转染0 ng）相比，实验组细胞中LC3-Ⅱ的含量随着Viperin转染量的增加而逐渐增加.从图1（b）可以看出，500 ng实验组中LC3-Ⅱ的相对密度约为对照组的2倍（P=0.0015），表明Viperin使胞内的LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转化，自噬体数量增多.自噬蛋白P62的含量逐渐减少，说明随着自噬体的增多P62随自噬流降解的效果增强.

图1 转染Viperin蛋白后HEK293细胞内LC3与P62的表达Fig.1 Expression of LC3 and P62 in HEK293 after transfection of Viperin

2.2 Viperin诱导自噬体形成

LC3-Ⅱ型增多可能是因为形成的自噬体数量增加或合成的自噬溶酶体数量减少[15].本研究通过免疫荧光技术观察在Viperin过表达细胞中GFP-mCherry-LC3介导的自噬体的形成，结果如图2所示.由图2（a）可以看出，同对照组相比，实验组中Viperin的过表达不仅使双色（黄色）的自噬体数量增加，而且使单色（红色）的自噬溶酶体数量增加.从图2（b）可以看出，实验组的黄色小体数量约为对照组的3倍，P=0.0453；实验组的红色小体数量约为对照组的2倍，P=0.0053.以上结果表明，Viperin诱导了自噬体的形成，但并未抑制自噬溶酶体的形成.

图2 Viperin对自噬体形成过程的诱导Fig.2 Induction of autophagosome formation by Viperin

2.3 Viperin促进自噬核心蛋白Beclin 1的表达

Beclin 1复合物是自噬通路中自噬体形成的核心蛋白[16].转染不同数量的Viperin后，A549细胞中自噬核心蛋白Beclin 1的表达情况如图3所示.由图3可以看出，随着Viperin转染量的增加，A549细胞中Beclin 1的表达量显著增加，进而诱导了LC3的脂化.

图3 转染不同剂量的Viperin后自噬核心蛋白Beclin 1的表达Fig.3 Expression of autophagy core protein Beclin 1 after transfection of Viperin

2.4 敲低Beclin 1对Viperin诱导LC3脂化的抑制

用siRNA转染HEK293细胞，敲低细胞内的Be clin 1表达，结果如图4所示.Western blotting结果表明，在转染siRNA后，HEK293细胞中的Beclin 1的表达量明显降低，Beclin 1的敲低降低了Viperin过表达细胞中LC3-Ⅱ的水平，该水平与对照组中的相近.这一结果也证实Viperin促进了Beclin 1依赖的细胞自噬的形成.

图4 敲低Beclin 1对Viperin诱导LC3脂化的抑制Fig.4 Knockdown of Beclin 1 inhibits lipidation of LC3 induced by Viperin

2.5 非人类灵长类动物中Viperin的生物学活性

与人类相比，非人类灵长类动物的ISG有更强的生物学活性，Viperin参与了包含人类在内的灵长类动物的正向选择[9].多种灵长类动物中Viperin对LC3和Beclin 1的作用结果如图5所示.由图5可以看出，在A549细胞中过表达不同物种的Viperin均会促进LC3-Ⅱ型的表达，与人类的Viperin相比，非人类灵长类动物的Viperin作用更强.同样，在A549细胞中，非人类灵长类动物的Viperin对Beclin 1的诱导作用更强.

图5 多种灵长类动物中Viperin对LC3-Ⅱ和Beclin 1的作用Fig.5 Effects of Viperin on induction of LC3-II and Beclin 1 in different Primates

3 结论

本研究通过一系列过表达和敲低Viperin蛋白表达的实验，证明Viperin在人表皮细胞中可以促进Beclin 1的表达，进而诱导了LC3的脂化，使自噬体形成，最终上调了细胞自噬的水平.近年来研究发现，Viperin对多种病毒的感染具有强烈抑制作用[17-18]，且抗病毒作用机制针对不同的病毒也各不相同.细胞自噬参与胞内的多种活动，多种入侵的病毒可被其相关蛋白识别，进而运送到自噬溶酶体中降解[19-20]，从而起到对病毒的抵抗作用.本课题组针对Viperin是否影响细胞自噬的水平进行初步探究.人类HEK293细胞中Viperin的表达水平极低，选取该细胞进行Viperin蛋白的过表达，发现Viperin蛋白的表达水平和活性均较好，可促进细胞中LC3的脂化，而且自噬体形成的效果比较明显.同时，Viperin过表达细胞中自噬标记蛋白P62的减少证明了自噬流的增强，表明该细胞中LC3的脂化及自噬体形成的上调并非由自噬流的抑制作用导致.自噬体的形成与自噬相关蛋白（ATGs）及Beclin 1的作用密切相关[19].本研究发现，在A549细胞中Viperin可明显促进Beclin 1的表达上调.进一步通过siRNA敲低Beclin 1的水平，发现Beclin 1水平下降能够抑制Viperin对细胞自噬的促进作用，证实Viperin是通过Beclin 1实现其上调细胞自噬的功能.

在Viperin进化与功能相关的研究中发现，Viperin作为抗病毒蛋白在许多物种中均有表达[21-23]，其中，人类与猩猩的Viperin具有较高同源性[24]，而非人类灵长类动物中的Viperin同其他已报道的抗病毒蛋白一样，与人类的同类抗病毒蛋白相比具有优势，这在一定程度上验证了抗病毒蛋白与物种进化选择的相关性.本研究在A549细胞中过表达了多种猴源和人源的Viperin蛋白，结果也证实了非人类灵长类动物中的Viperin促进Beclin 1上调的作用较强.