接种内生菌对干旱胁迫下甘蔗的生理影响

谷书杰，钱禛锋，娄永明,2，沈庆庆，普凤雅，曾 丹，马 豪，何丽莲，李富生,3

（1云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201；2耿马县地方产业发展服务中心，云南耿马 677500；3云南省作物生产与智慧农业重点实验室，昆明 650201）

0 引言

甘蔗(Saccharumofficinarum)是高光效的C4作物，无论是生物产量还是经济产量，相对于其他作物都更高，并且与淀粉糖等相比，蔗糖更容易利用，因此甘蔗一直是最重要的糖料作物和能源作物[1]。中国是世界第三大甘蔗种植国，而广西、云南、广东和海南是国内甘蔗的主产区，但从地形地貌上看，这些省份又多山多坡耕地，普遍灌溉条件较差，并且近些年甘蔗的种植逐渐转向干旱缺水的山区、坡地[2]。甘蔗苗期、分蘖期和整个营养生长阶段对水分都非常敏感，在一些雨热同季的地区干旱甚至可以降低甘蔗60%的产量[3]。干旱胁迫诱导破环植株体内的生理生化反应，导致代谢紊乱，严重阻碍作物生产[4-5]。干旱胁迫限制着全世界70%以上耕地的生产力[6-7]，探索作物抗旱机理和如何提高其抗旱能力一直都是各种作物的研究热点[8-9]。植物内生菌的概念于1866年首次被De Bary提出[10]。随着社会的发展，植物内生菌以内生、用途广、资源丰富、环境友好等特点成为近些年的研究热点，也被广泛应用于不同领域[11-13]。植物内生菌不仅具备良好的定殖能力，还可以通过产生植物激素、ACC（乙烯合成的直接前体，1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶、渗透调节物质和胞外多糖等促进植物生长和帮助植物抵御逆境[14-17]。植物内生菌的研究利用主要集中在小麦[17-18]、玉米[19]、水稻[20-21]等作物上，并且以促进生长、防御病虫害和抵御盐胁迫为主，探究内生菌对甘蔗抗旱能力方面的影响还鲜有报道。随着近几年全球气候的不断变化，各地干旱状况日益加剧，预计到2050年，干旱将对全世界50%以上的耕地造成严重的影响[22]。并且随着全球气温升高和土壤湿度的变化，极有可能出现全球性的长期干旱[23]，尤其是在非洲和亚洲，干旱情况恶化的可能性会更高[24]。在这种大环境下，人们已经通过杂交育种和分子育种选育抗旱作物品种来应对干旱胁迫，但是育种进程缓慢。前人研究表明，利用内生菌提高作物耐旱能力是具备可行性的，并且这类内生菌可以很快应用到生产中[25-31]。如何在日益加重的干旱条件下保证农业生产是一项重大的挑战，保证有限供水条件下的作物产量对保障社会稳定和安全至关重要[32]。本研究利用6株甘蔗内生菌为目的菌株，从生理生化的角度探索甘蔗内生菌在重度干旱胁迫下对苗期‘ROC22’的影响，以期揭示甘蔗内生菌对‘ROC22’抗旱能力的影响途径，为甘蔗内生菌的开发和广泛利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

甘蔗内生菌C9（醋酸钙不动杆菌）、C12（枯草芽孢杆菌）、YC89（贝莱斯芽孢杆菌）、E3（阿氏肠杆菌）、C6（阴沟肠杆菌）和O9（粘质沙雷氏菌）等6株甘蔗内生菌均由云南农业大学甘蔗研究所提供。

1.2 试验材料

试验材料为‘新台糖22’(‘ROC22’)，由云南农业大学甘蔗研究所提供。通过盆栽的方式种植在云南农业大学甘蔗研究所的大棚内。塑料盆口径75 cm、高50 cm，盆底有3个孔，土壤取自云南农业大学甘蔗研究所的红壤土和腐殖土按1:1比例混合。设置6个处理（分别接种6株甘蔗内生菌）、1个对照，每个处理和对照设置3个重复，共21盆。

1.3 材料处理

材料生长至第3片叶完全展开（苗期）时开始接种甘蔗内生菌。接种方式采用灌根法。将6株甘蔗内生菌接种到LB(Luria-Bertan)液体培养基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，pH 7.0。固体加15 g/L琼脂）培养48 h后，于8000 r/min离心10 min收集菌体，用无菌水重悬，采用稀释涂布平板法计数，菌液于4℃保存备用。接种浓度为1×107cfu/g。对照灌溉等体积的无菌水。接菌7天后进行干旱胁迫处理，处理至第10天于当天19:00取土样，采用烘干称重法测定土壤含水量，确定土壤含水量在20%左右，达到重度干旱胁迫[33]。于次日7:00取每盆甘蔗幼苗+1叶（完全展开的第一叶）4℃保存备用，用于进行后续试验。

1.4 数据测定方法

菌株ACC脱氨酶活性用Penrose等[34]的方法测定。

土壤含水量的测定采用环刀（铝盒）取样烘干称重的方法，先将铝盒编号，烘干至恒重W0，然后取土称重W1，烘干至恒重W2，计算如式(1)。

叶片含水量测量也采用烘干称重的方法；植物叶片组织逆境膜伤害程度的测定用电导仪法；植物叶片组织中可溶性蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250法；叶绿体色素含量测定用分光光度法；植物叶片组织中可溶性糖、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸(Pro)含量、过氧化物酶(POD)活性、超氧物歧化酶(SOD)活性用购自北京索莱宝科技有限公司的试剂盒测定。

1.5 数据处理方法

使用SPSS 25.0和Microsoft Excel 2019处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 甘蔗内生菌菌株的ACC脱氨酶活性

如表1所示，E3、O9和YC89有较高的ACC脱氨酶活性。方差分析表明，E3菌株的ACC脱氨酶活性极显著高于YC89，O9菌株的ACC脱氨酶活性极显著高于YC89。C12、C9和C6株菌ACC脱氨酶活性极显著低于E3、O9和YC89。

表1 不同菌株ACC脱氨酶活性

2.2 干旱胁迫后的土壤含水量

如表2所示，各处理之间土壤含水量均在20%左右。方差分析表明，各处理之间差异不显著。

表2 干旱胁迫10天后的土壤含水量

2.3 ‘ROC22’苗期叶片的生理状态

2.3.1 ‘ROC22’苗期叶片含水量 如表3所示，叶片含水量最高的是YC89处理，最低的是O9，两者相差6.99个百分点。方差分析结果表明。接种YC89的植株叶片含水量极显著高于CK和其他处理。接种C6和C9菌的叶片含水量极显著高于E3、O9、C12。E3、O9、C12处理和CK之间差异不显著。

2.3.2 ‘ROC22’苗期叶片的电导率 如表3所示，细胞膜受损最严重的是CK，电导率达到7.25%，受损程度较小的是E3、O9和YC89。方差分析结果表明，CK和C9电导率极显著高于其他处理。处理之间比较，E3和O9之间差异不显著，但是极显著低于C12、C9、C6、YC89。YC89极显著低于C6和C16，C6和C12之间差异不显著。

2.3.3 ‘ROC22’苗期叶片的叶绿素含量 重度干旱胁迫下，接种不同菌株对甘蔗植株叶片叶绿素含量影响差异不大（表3）。方差分析表明，各处理之间差异不显著，与CK相比差异也不显著。

表3 不同处理对叶片生理状态的影响

2.4 ‘ROC22’苗期渗透调节物质

2.4.1 ‘ROC22’苗期叶片可溶性糖含量 植株受到干旱胁迫信号的诱导，可溶性糖被大量积累用于抵御渗透胁迫。如表4所示，可溶性糖含量最高的是YC89，其次是E3，最低的是CK。方差分析表明，接种YC89菌的‘ROC22’苗期叶片中积累的可溶性糖极显著高于CK和其他处理；接种E3的‘ROC22’苗期叶片积累的可溶性糖极显著高于CK和除YC89外的其他处理；O9、C12和C6处理之间差异不显著，但极显著高于C9和CK；C9极显著高于CK。整体来看，接种甘蔗内生菌的‘ROC22’植株较CK都积累了更多的可溶性糖来抵御干旱胁迫。

2.4.2 ‘ROC22’苗期叶片可溶性蛋白含量 如表4所示，可溶性蛋白含量最低的是CK，最高的是E3，两者相差5.73%。方差分析表明，重度干旱胁迫下，接种E3菌株的‘ROC22’苗期叶片可溶性蛋白含量极显著高于CK和其他处理；接种YC89和C12菌株的‘ROC22’苗期叶片可溶性蛋白含量与YC89之间差异不显著，但是极显著高于C6、C9和CK，C6、C9和CK之间差异不显著。

2.4.3 ‘ROC22’苗期叶片Pro含量 Pro不仅参与渗透调节，还参与降低细胞酸性等生化反应。如表4所示，‘ROC22’苗期叶片Pro积累量最高的是YC89，达到了110.21 μg/g，最低的为C12，仅为68.09 μg/g。方差分析表明，在重度干旱胁迫下，接种YC89的‘ROC22’苗期叶片中积累的Pro含量，极显著高于CK和其他处理；其次是E3和O9，极显著高于CK、C12、C9和C6；C9极显著高于CK、C12和C6；C6和CK之间差异不显著。

表4 不同处理对叶片渗透调节物质含量的影响

2.5 ‘ROC22’苗期叶片膜脂过氧化程度

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度。接种不同甘蔗内生菌对重度干旱胁迫下的‘ROC22’苗期叶片膜脂过氧化程度的影响如表5所示，膜脂过氧化程度最高的是CK，MDA含量达到了19.82 nmol/g，最低的是O9和E3。方差分析表明，在重度干旱胁迫下，接种E3和O9菌株的‘ROC22’叶片中MDA积累量极显著低于CK和除YC89外的其他处理；YC89极显著低于CK和C12；C9显著低于C6和C12，极显著低于CK；C6和C12显著低于CK。

表5 不同处理对叶片MDA含量的影响

2.6 ‘ROC22’苗期叶片保护酶活力

2.6.1 ‘ROC22’苗期叶片POD活性 表6表明，POD活性最高的是YC89，达到了3828.04 U/g，其次是E3，最低的是C9。重度干旱胁迫下，接种YC89菌株的‘ROC22’叶片中POD活性极显著高于CK和其他处理；E3极显著高于CK和除YC89外的其他处理；O9、C6、C12和CK之间差异不显著，但是极显著高于C9。

2.6.2 ‘ROC22’苗期叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性 如表6所示，SOD活性最高的是E3和YC89，最低的是CK。方差分析表明，接种E3、O9、YC89和C6菌株的‘ROC22’苗期叶片SOD活性之间差异不显著，但显著高于CK；C12、C9、C6和CK之间差异不显著。

表6 不同处理对叶片POD和SOD活性的影响

3 结论

本研究以6株甘蔗内生菌为供试菌株，测定其ACC脱氨酶活性，于‘ROC22’苗期接种，在重度干旱胁迫条件下测定苗期植株+1叶抗旱相关生理生化指标和酶活性，发现这6株甘蔗内生菌对‘ROC22’抗旱能力有一定的促进作用。其中产ACC脱氨酶的E3、O9和YC89菌在降低干旱胁迫对‘ROC22’苗期叶片组织的损伤效果极显著，在减少叶片细胞膜的损伤和细胞失水、增加渗透调节物质的积累、提高保护酶活性中发挥重要作用，本试验表明，产ACC脱氨酶的甘蔗内生菌能有效提高甘蔗抗旱能力，拓宽了提高甘蔗抗旱能力的途径，为合理利用甘蔗内生菌提高甘蔗抗旱能力提供了理论依据。

4 讨论

本研究首次探究甘蔗内生菌对甘蔗抗旱能力的影响，研究结果表明，接种甘蔗内生菌后的‘ROC22’苗期在遭受重度干旱胁迫的时候叶片损伤程度相较于CK更低，一方面体现在保护了细胞膜使其更完整，电导率更低，另一方面降低了叶片水分的散失，这与Vardharajula等[35]的研究结果基本一致。但是本研究中6株甘蔗内生菌对甘蔗叶绿素含量影响并不显著，猜测可能是细胞膨压保持较好，叶绿素分解较少。干旱胁迫下，作物会积累大量渗透调节物质维持渗透势减少水分损失，从而抵御干旱胁迫[36]。Govindasamy等[37]研究发现，盆栽试验中高粱内生菌能通过增加植物叶片内脯氨酸积累量来增加高粱的抗旱性；Ois等[38]的研究表明，接种枯草芽孢杆菌B26能显著提高干旱胁迫条件下梯牧草根和芽中的渗透调节物质，从而提高梯牧草的抗旱性，在本研究中，甘蔗内生菌YC89显著提高了甘蔗渗透调节物质的积累量，这与前人研究结果基本一致，也进一步说明甘蔗内生菌在促进甘蔗积累渗透调节物质中起到重要作用。脯氨酸(Pro)除作为植物细胞质内渗透调节物质外，还在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用，本研究中E3、C6和YC89甘蔗内生菌极显著提高了‘ROC22’干旱胁迫下的Pro积累量。丙二醛(MDA)直接反映细胞膜质过氧化程度的高低，本研究中甘蔗内生菌E3、O9和YC89处理的MDA含量极显著低于CK，表明其在降低膜质过氧化中的作用，与严美玲等[39]的研究结果基本一致。不仅如此，植物内生菌还会通过提高作物过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性来降低或消除干旱胁迫对细胞的损伤[40-41]，在本研究中，E3和YC89对‘ROC22’干旱胁迫下苗期叶片SOD和POD活性具有显著的促进作用。

1-氨基环丙烷-1羧酸(ACC)是乙烯合成的直接前体，ACC脱氨酶在减轻干旱胁迫给作物带来的不利影响方面起着至关重要的作用[42-43]。本研究测定了6株甘蔗内生菌的ACC脱氨酶活性，发现E3、O9和YC89均有较高的酶活性，结果表明，重度干旱胁迫下，这3株甘蔗内生菌对减少叶片失水、增加渗透调节物质的积累和提高氧化酶活性有显著效果，这与前人研究结果[15,44]基本一致。E3、O9和YC89对干旱胁迫产生的负面影响有很大的抑制作用，因此膜质过氧化程度较低，积累的Pro也相对较少。前人研究[42,45-46]表明,产ACC脱氨酶的菌株会提高作物的叶绿素水平，但是本研究中只有E3菌能显著提高叶绿素含量，另外2株产ACC脱氨酶的甘蔗内生菌（O9和YC89）对叶绿素含量影响并不显著，这可能是由于这2株产ACC脱氨酶的甘蔗内生菌促进甘蔗生长效果不强。并且在本研究中，不是所有内生菌对甘蔗生理指标的影响都是正向的，主要表现为与CK相比，C9显著降低了‘ROC22’叶片中的POD活性，C12降低了叶片Pro含量。从生理生化的角度，本研究发现产ACC脱氨酶的甘蔗内生菌能提高甘蔗的抗旱性，今后的研究可以从分子的角度进一步探究，产ACC脱氨酶的内生菌对甘蔗体内代谢通路影响情况、基因被诱导高表达或者抑制表达的情况。