采后处理对香蕉果实ACC合成酶基因表达的影响

何 冰，武爱龙，沈一跃，郑佳明，吴建阳

(1 湛江幼儿师范专科学校，广东湛江，524037；2 岭南师范学院基础教育学院，广东湛江，524037)

乙烯是一种植物生长调节剂，对果实成熟与衰老起关键作用[1]。植物体内乙烯生物合成途径为：在腺苷蛋氨酸合成酶的作用下蛋氨酸转变成腺苷蛋氨酸，接着在ACC合成酶 (ACS)作用下腺苷蛋氨酸转变成ACC，最后在ACC氧化酶(ACO)催化下生成乙烯[2-4]，因此，ACS是乙烯合成路径中的关键限速酶。

ACS由多基因家族编码，目前，多种果树已从基因组层面分离出ACS基因家族所有成员[5-7]，且与果实成熟相关的关键ACS基因也被阐明[8-9]。香蕉基因组测序早已完成[10-11]，借助于香蕉基因组数据库，本课题组共鉴定出12个ACS基因家族成员[12]，但鲜有从基因组层面系统研究ACS基因在香蕉果实成熟过程中的表达情况。本研究在香蕉采后，通过乙烯利、自然成熟和1-甲基环丙烯(1-MCP)处理，分析ACS基因家族成员表达，据此初步阐明调控香蕉采后成熟的关键ACS基因。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

巴西蕉MusaacuminateL.AAA group ‘Brazilian’，来自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所香蕉园(广东湛江)，采摘七八成熟果实，立即运回实验室，每梳香蕉分成单个果指后，用清水洗净，去除残花，挑选均匀一致的无病虫害、无机械伤的果实，清水洗净，经500 mg/L施保功处理3 min后晾干待用。

挑选成熟度一致的香蕉分成3份，一份自然成熟，一份用500 mg/L乙烯利处理，一份用500 mg/L 1-MCP处理18 h，处理后均用打孔聚乙烯包装袋包装，放置25 ℃室温正常后熟，定期观察和取样分析。采摘当天记为0 d并取样，自然成熟的1、4、7、17 d取样，乙烯利处理后1、4、7 d取样，1-MCP处理后1、4、7、17、21 d取样果肉(见图1)，放于-80 ℃冰箱保存备用，提取RNA。

图1 不同处理不同时间巴西香蕉果实比较

1.2 香蕉MaACS荧光定量表达分析

采用华越洋生物科技有限公司的产品，植物RNA提取试剂盒提取香蕉总 RNA。每个样品取1 μL检测RNA质量和浓度后，利用M-MLV逆转录酶(TaKaRa 公司)合成cDNA链。选用NCBI上已登录的香蕉MaActin片段为内参，引物序列根据已登录序列进行设计，根据转录组测序结果查找采后成熟过程中ACS表达量高且有差异的基因，共计4个，根据基因的ID号查找已测序香蕉基因组中选定的MaACS编码序列，设计相应的荧光定量引物。引物序列见表1。

表1 MaACS引物序列

实时定量PCR采用TaRaKa公司试剂盒，染料为SYBR Green，在RoChe Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行。PCR反应体系为20 μL，PCR产物长度为200 bp左右。荧光定量PCR的反应程序为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循环40次。每个反应重复3次。

2 结果与分析

2.1 乙烯利处理采后香蕉不同时间MaACS的实时荧光定量相对表达

从图2可以看出，乙烯利处理后MaACS4、MaACS6、MaACS10在成熟过程中表达上调，其中处理后7 dMaACS10相对表达量最高，其次是MaACS4，处理后不同时间MaACS6表达量差异不明显。而MaACS13在成熟过程的表达量在处理后4 d达到峰值，随后表达量急剧下降。

图2 乙烯利处理采后香蕉不同时间香蕉MaACS的实时荧光定量相对表达

2.2 自然成熟香蕉采后不同时间MaACS的实时荧光定量相对表达

从图3可以看出，自然成熟过程中MaACS4表达量在处理后0～7 d逐渐下调，17 d完全成熟的香蕉果实中表达量急剧上调。MaACS6表达量在处理后1 d达到峰值，随后表达下调，17 d的表达量与0 d差异不明显。MaACS10随着果实成熟表达量上调，处理后17 d达到峰值。MaACS13在前面4个时间点表达量稍有增加，但处理后17 d表达量显著下调。

图3 自然成熟香蕉采后不同时间MaACS的实时荧光定量相对表达

2.3 1-MCP处理采后香蕉不同时间MaACS的实时荧光定量相对表达

从图4可以看出，1-MCP处理后MaACS4在0～1 d表达量稍有下降，4～17 d表达量上调，且表达量与0 d基本一致，21 d表达量急剧上调。MaACS6表达量在0～1 d快速下降，1～17 d显著增加，21 d稍有下降。MaACS10表达量在0～4 d几乎无变化，7～21 d显著增加，并在21 d达到峰值。MaACS13在0～1 d表达量显著下降，1～4 d表达量快速增加，4～17 d表达量稍有波动，21 d表达量急剧下调。

3 结论与讨论

3.1 不同处理对香蕉ACS基因家族成员表达的影响

香蕉富含蛋白质、维生素、淀粉和糖等营养物质，是仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物[13]，目前，超过150个国家都在种植香蕉，每年可以生产1.05亿t[14]。中国是继印度之后第二大香蕉生产大国，广东、海南、云南是中国生产香蕉的3个主要省份[15]。香蕉属于呼吸跃变型果实，外源乙烯处理可以促进内源乙烯的生成，进而促进果实成熟与衰老[16-17]。1-MCP是一种乙烯受体抑制剂，通过与乙烯受体不可逆结合来阻断乙烯生成，进而延缓成熟衰老[18]。

Yuan等利用外源乙烯处理梨果实，发现13个ACS基因中有4个ACS基因受外源乙烯处理诱导表达[19]；利用外源乙烯处理番茄果实研究表明，在番茄8个ACS基因中，LEACS1A和LEACS6表达量下降，LEACS2表达量增加，LEACS4未检测到表达[20]。本研究发现，外源乙烯处理可以促进香蕉成熟，在此过程中，ACS基因家族成员表达量呈现3种不同趋势。第一种为MaACS4和MaACS10，前期表达量较低且变化不大，后期显著增加；第二种为MaACS6，先降低后增加；第三种为MaACS13，先降低后增加再降低。尽管ACS基因家族成员表现出3种表达趋势，但只有MaACS10的表达倍数发生千倍的变化。

番茄果实在自然成熟过程中，8个ACS基因中，LEACS1A表达量先增加后降低，LEACS2和LEACS4表达量增加，LEACS6表达量下降，另外4个ACS基因未检测到表达[20]。李中有4个ACS基因，“Early Golden”和“Shiro”品种自然成熟过程中PsACS4和PsACS5分别表现出受乙烯正调控和负调控[21]。本研究表明，香蕉在自然成熟过程中，ACS基因家族成员表达量呈现2种不同趋势。MaACS4和MaACS10前期表达量较低且变化不大，后期显著增加，属于一种类型；另一种为前期先增加后期降低，MaACS6和MaACS13即属于该类型。尽管ACS基因家族成员表现出2种表达趋势，但只有MaACS10的表达倍数发生千倍的变化。

利用1-MCP处理梨果实，发现13个ACS中有2个基因受1-MCP处理诱导表达[19]；利用1-MCP处理李果实研究表明，李4个ACS基因中，PsACS3表达量不受影响，果肉中PsACS1和PsACS4的表达量受到严重抑制[21]。本研究发现，1-MCP处理可以延缓香蕉成熟，在此过程中，ACS基因家族成员表达量呈现2种不同趋势。MaACS4和MaACS10前期表达量较低且变化不大，后期显著增加，为一种类型；另一种为先降低后增加再降低，MaACS6和MaACS13属于这种。尽管ACS基因家族成员表现出2种表达趋势，但只有MaACS10的表达倍数发生千倍的变化。

3.2 调控香蕉成熟的关键ACS基因

对苹果的研究表明，MdACS1和MdACS3a对调控果实发育成熟具有重要作用[22-23]；番茄中，LeACS1a、LeACS2、LeACS4和LeACS6基因与果实发育成熟密切相关[24]；CmACS1、CmACS7和CmACS11对调控果实成熟发挥着重要作用[25-27]；DKACS1基因影响着柿果的成熟过程[28]；RiACS1与树莓果实成熟密切相关[29]。本研究表明，MaACS4在乙烯利、自然成熟和1-MCP处理后的表达趋势一致，均为前期变化不大，成熟时快速增加，但最终上调倍数小于10。乙烯利和1-MCP处理后，MaACS6表达量先下降后增加，自然成熟则先增加后下降。3种处理的MaACS10表达量前期比较低且变化不大，但在成熟时急剧增加并达到峰值，最终上调倍数达到约1 700倍。乙烯利和1-MCP处理后，MaACS13表达量先下降后增加再下降，自然成熟的前期变化不大，但成熟时显著下降。由于在4个ACS基因家族成员中，只有MaACS10在3个不同处理中的表达趋势一致，且最终表达量上调约1 700倍，推测MaACS10是调控香蕉成熟的关键基因。