黄芪多糖对巨噬细胞活化及其吞噬功能的影响

罗晶晶，王旭溟，计坚，瞿浩，罗成龙，邹娴，舒鼎铭，王劼

（广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广东广州 510640）

黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS）是一种从黄芪中提取的植物多糖，具有抑菌、抗病毒、抗氧化作用和免疫调节活性，因其资源丰富、毒副作用小等优点而逐渐受到关注并应用于畜禽生产中。APS 可以增强动物机体对H9N2 禽流感、口蹄疫、新城疫和传染性法氏囊等多种疫病的抗病能力，显著增加畜禽的T 淋巴细胞增殖，并增加抗体水平；还可以减轻脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的鸡和仔猪免疫应激反应。由此可见，APS 在畜牧生产中具有广阔的开发和应用前景，但APS 的免疫作用机制尚未明确。

巨噬细胞是动物机体先天免疫系统的关键组成部分，它对细胞残片、病原体以及抗原-抗体复合物进行噬菌作用（吞噬和消化），并作为抗原呈递细胞（Antigen Presenting Cells，APCs）。活化的巨噬细胞表达主要组织相容性复合体II（Major Histocompatibility Complex Class II，MHC-II）类分子、协调刺激分子CD80、CD86 等，在存在抗原依赖性炎症反应的情况下诱导有效的T 细胞反应，在适应性免疫系统的激活过程中发挥重要作用。本试验通过研究体外APS 对巨噬细胞的增殖活性、活化和吞噬功能的影响，以进一步加深APS 对免疫系统调节作用的认识，为其在畜禽生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 APS（纯度>99%，国内某生物股份有限公司）。完全培养基（DMEM）高糖细胞培养基、青链霉素（上海生工生物有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（美国Gibco 公司）。6 孔板、96孔板（美国Thermo 公司）。CCK-8 试剂盒（杭州四清生物工程材料有限公司），抗小鼠CD80-FITC 抗体、抗小鼠CD86 Percp-cy-5.5 抗体、抗小鼠MHC-II PE 抗体（美国eBioscience 公司）。FITC-dextren（1 mg/mL，分子量40 000，美国Sigma 公司）。二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技有限公司，中国），低温高速离心机（Thermo Fisher，美国），超净工作台702038（苏净安泰 SW-J-1FD），FACS calibur 流式细胞仪（Becton-Dickinson，美国），酶联检测仪（Thermo Fisher，美国）。

1.2 APS 悬液制备 用电子天平精确称取5 mg APS，用5 mL 无菌PBS 配成浓度为1 000 μg/mL 的悬浮液，在超净台内用0.22 μm 孔径的滤膜过滤以除去试剂中的细菌，再用1.5 mL 离心管分装后，置于4℃冰箱中保存。使用时，用完全培养基（DMEM）培养基、1%青霉素/链霉素、10% 胎牛血清配成不同浓度（0.1、1、10、50、100 μg/mL）的APS 悬液，现配现用。

1.3 RAW264.7 细胞培养 RAW264.7 细胞系购于美国典型培养物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。细胞培养于含10% 胎牛血清和1% 链霉素/青霉素的DMEM 培养基中，置37℃、饱和湿度、5%CO的培养箱中培养，每1～2 d 传代1 次。

1.4 CCK-8 法检测细胞增殖活性 CCK-8 在细胞脱氢酶的作用下生成的甲瓒物数量与活细胞数量成正比，因此用其表示细胞增殖活性。严格按照CCK-8 试剂盒说明书操作，将100 μL 初始浓度约为1×10个/mL 的细胞悬液接种至96 孔板，并在培养箱中培养，培养条件：以DMEM（含10% 胎牛血清，1% 青链霉素双抗）为培养基的，培养条件：37℃、5%CO、95%空气。等到细胞完全粘附后，吸出上清液，分别添加100 μL 不同浓度的APS（0.1、1、10、50、100 μg/mL，对照组为0 μg/mL）培养基于同一平板样品孔中（每个处理组设8个复孔）培养12h；培养结束后，每处理孔加入10 μL CCK-8 溶液后，放回培养箱继续孵育1 h。1 h 后取出96 孔板并使用酶标仪在波长450 nm 处检测每孔的光密度（在加入CCK-8 溶液后，所有操作均避光）。以对照组OD 值调零，巨噬细胞增殖率计算公式：巨噬细胞增殖率=（As-Ac）/Ac ×100%，其中As 为实验组 OD值，Ac 为空白对照组 OD 值。

1.5 APS 对巨噬细胞表面分子表达的影响

1.5.1 CD80 分子的表达检测 巨噬细胞的CD80 分子的表达水平利用FITC 阳性细胞的百分比来表示。将细胞以5×10个/mL 接种于6 孔培养板中，用不同浓度APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100 μg/mL，对照组为0 μg/mL）培养基于37℃、5%CO培养箱中培养12 h。培养结束后，洗脱收集细胞，将细胞与抗小鼠CD80-FITC 的抗体在冰上孵育30min 后，再用PBS 液洗涤两次以去除多余抗体，然后在FACS calibur 流式细胞仪中进行检测分析。

1.5.2 CD86 分子的表达检测 巨噬细胞的CD86 分子的表达水平利用Percp-cy-5.5 阳性细胞的百分比来表示。将细胞以5×10个/mL 接种在6 孔培养板中，用不同浓度APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100 μg/mL，对照组为0 μg/mL）培养基于37℃、5%CO培养箱中培养12 h。培养结束后，洗脱收集细胞，为检测CD80 的细胞表面表达，将细胞与抗小鼠CD86 Percp-cy-5.5 抗体在冰上孵育30 min 后，再用PBS 洗涤2 次以去除多余抗体，然后在FACS calibur 流式细胞仪中进行检测分析。

1.5.3 MHC-II 分子的表达检测 MHC-II 分子表达水平采用PE 阳性细胞的百分比来表示。将细胞以5×10个/mL接种于6 孔培养板中，用不同浓度APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100 μg/mL，对照组为0 μg/mL）培养基于37℃、5%CO培养箱中培养12 h。培养结束后，洗脱收集细胞，将细胞与抗小鼠MHC-II PE 抗体在冰上孵育30 h，再用PBS 洗涤2 次以去除多余抗体，然后在FACS calibur 流式细胞仪中进行分析。

1.6 APS 对细胞吞噬活性的影响 巨噬细胞对FITCdextren 的摄取量反映其吞噬活性，其吞噬率由FITC阳性细胞的百分比表示，其吞噬能力由细胞的平均荧光强度（MFI）表示。通过流式细胞术定量，用FITC-dextren 阳性细胞的百分比来表示巨噬细胞的吞噬率，FITC-dextren 阳性细胞平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity，MFI) 则表示单个巨噬细胞细胞的吞噬能力。细胞以5×10个/mL 的浓度接种在12 孔培养板中，并用不同浓度的APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100μg/mL，对照组为0μg/mL）培养基在37 ℃、5%CO培养箱中孵育12 h，然后在FITCdextren 存在下孵育30 min。温育后，将细胞在PBS中洗涤2 次以除去过量的FITC-dextren，洗脱收集细胞。FITC-dextren 阳性细胞百分比和平均荧光强度通过FACS calibur 流式细胞仪进行分析。

1.7 统计分析 使用Flowjo V10 分析来自FACS calibur流式细胞仪的数据，数据均以平均值±标准差表示，并且采用SPASS 22.0 统计软件进行单因素方差分析，用Duncan's 法进行多重比较。

2 结果

2.1 APS 对巨噬细胞增殖活性的影响 如图1 所示，与对照组相比，低浓度的APS（0.1、1 和10 μg/mL）对巨噬细胞的增殖无显著影响，而高浓度的APS（50 和100 μg/mL）可提高巨噬细胞增殖能力（<0.001）。

图1 不同浓度的APS 对巨噬细胞增殖活性的影响

2.2 APS 对巨噬细胞活化的影响 如图2 所示，与对照组相比，50 μg/mL 以上的APS 能促进巨噬细胞CD80 分子的表达（<0.001）。如图3 所示，与对照组相比，APS浓度达到100 μg/mL 能促进巨噬细胞CD86 分子的表达（<0.05)。如图4 所示，与对照组相比，高浓度APS（50 μg/mL 和100 μg/mL）处理能促进MHC-II 分子表达（<0.001）。由此表明添加高浓度APS（50 μg/mL 和100 μg/mL）可以增强巨噬细胞的抗原呈递能力。

图2 不同浓度APS 对巨噬细胞表达CD80 分子的影响

图3 不同浓度APS 对巨噬细胞表达CD86 分子的影响

图4 不同浓度APS 对巨噬细胞表达MHC-II 分子的影响

2.3 APS 对巨噬细胞吞噬活性的影响 如图5 所示，APS 对巨噬细胞的吞噬能力具有一定的促进作用，50 μg/mL 的APS 能够提高巨噬细胞吞噬能力（<0.05），100 μg/mLAPS 对其吞噬能力有提高作用（<0.001）。如图6 所示，与对照相比，APS 浓度达到100 μg/mL时巨噬细胞吞噬率增加（<0.05）。

图5 不同浓度APS 对巨噬细胞吞噬能力的影响

图6 不同浓度APS 对巨噬细胞吞噬率的影响

3 讨 论

巨噬细胞对机体的免疫系统非常重要，它在体内发挥监视、防御、抗原呈递、调节以及清除凋亡细胞等功能，是机体免疫防御的第一道防线。巨噬细胞的激活是放大对病原体或其他应激源的先天免疫应答中的关键步骤，可以通过测定体外巨噬细胞的增殖活性来评估巨噬细胞是否被激活。本试验参考其他多糖调节免疫活性的文献，设置不同浓度（0～100 μg/mL）的APS 以研究其对巨噬细胞增殖活性的影响，结果显示巨噬细胞增殖活性随着APS 浓度（0.1～100 μg/mL）增加而增加，呈现剂量依赖效应，其中50、100 μg/mL 的APS 能够显著提高巨噬细胞的增殖活性，表明一定浓度的APS 可以通过激活巨噬细胞来增强先天免疫应答。

MHC-II、CD80 和CD86 是巨噬细胞活化的标志分子。巨噬细胞吞噬抗原产生的多肽片段与MHC-II 结合被运输到质膜，然后与CD4 辅助T 细胞相互作用，诱导抗原特异性的T 细胞活化、增殖、产生免疫记忆，并刺激多种细胞因子的产生和分泌。当巨噬细胞受抗原刺激活化后，共刺激分子CD80/86 开始高表达，进一步促进细胞因子的产生，增强激活T 细胞的作用。本试验中，100 μg/mL 的APS 可显著促进巨噬细胞CD80、CD86 和MHC-II 分子表达，表明一定浓度的APS 有利于巨噬细胞在抗原刺激下快速活化，加速抗原呈递。

吞噬率和吞噬能力的增强是活化的巨噬细胞最显著的特征之一，这有助于宿主防御以及自身免疫。本研究结果表明，巨噬细胞的吞噬率随着APS 浓度（0.1～100 μg/mL）增加而增强，呈现剂量效应，其中100 μg/mL 的APS 能够显著提高巨噬细胞的吞噬率；50 μg/mL 和100 μg/mL 的APS 能显 著提高 巨噬细 胞的吞噬能力。这可能是在日粮中添加APS 能显著增强肉鸡免疫能力的原因之一，也与白术、何首乌等中草药多糖被证实能增强巨噬细胞的吞噬活性的结论一致。多糖的功能与结构密切相关，APS 经分离纯化主要分为APS-1 和APS-22 种组分，APS-2 是主要的免疫活性成分，由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成。有研究表明APS-2 中的-1，4--葡萄糖单糖残基能够有效促进T 淋巴细胞增殖，但-1，2，5--阿拉伯糖、-1，3，4--半乳糖、-1，2-L-鼠李糖等单糖残基与APS-2 免疫活性之间的关系尚未有研究。

4 结 论

本研究中，APS 通过促进巨噬细胞增殖，上调巨噬细胞表面CD80、CD86、MHC-II 分子的表达，提高吞噬细胞的吞噬能力，但其分子机制仍需进一步研究。