半胱氨酸对17℃保存杜洛克猪精液品质及抗氧化能力的影响

刘 敏，陈璐，曾怡铭，白丁平，黄小红*

（1.中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室，福建福州 350002；2.福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福建福州 350002）

人工授精是目前最有效的生猪繁殖技术，为我国生猪品种改良和选育做出巨大贡献，迅速推动了我国养猪业的发展。精液品质是人工授精技术的关键因素，提高精液保存质量有助于提高人工授精成功率。在实际生产中，主要采用常温保存下的猪精液进行人工授精。但精液中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）随着保存时间的增加而增加，过量ROS 会损伤精子结构，破坏精子基本功能，甚至加速精子死亡，导致精液品质下降。研究表明，在精液保存期间添加抗氧化剂可缓解精子氧化损伤，提高精液质量。因此，众多学者尝试在稀释液中加入抗氧化剂来改善精液品质。

半胱氨酸（Cysteine，CYS）属于氨基酸类抗氧化剂，具有良好的抗氧化活性。CYS 一方面可合成谷胱甘肽并增强谷胱甘肽过氧化物酶活性以消除ROS，另一方面经半胱氨酸脱酸酶分解生成牛磺酸，能有效清除自由基，显著改善精液品质。目前，CYS 作为抗氧化剂已应用于人、水牛精液冷冻保存中，但将CYS 添加到杜洛克猪精液17℃保存的应用研究未见报道。因此，本实验旨在研究CYS 对17℃保存的杜洛克猪精子活力、渐进运动率、质膜完整率、顶体完整率以及抗氧化能力的影响，为CYS 运用到猪精液17℃保存中提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验精液 本实验所用杜洛克猪精液由福建永城华多种猪场提供。采集6 头成年健康、体况良好的杜洛克公猪混合精液，选取色泽乳白、无异味、射精量正常的精液，于2 h 内送达实验室，精子活力大于70%方可用于后续实验。

1.2 主要试剂 CYS、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠、氯化钾、青霉素钾均购自海麦克林生化科技有限公司；硫酸链霉素购自美国INALCO 公司；果糖、乙酸、甲醇均购自国药集团化学试剂有限公司；DAPI溶液购自北京索莱宝科技公司；异硫氰荧光素-花生凝集素荧光染液购自美国Sigma-Aldrich 公司；总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器 数显恒温水浴锅HH-4 购自国华电器有限公司；17℃恒温箱购自北京福意电器有限公司；AMG EVOS 无目镜数码倒置显微镜（荧光型）购自美国AMG 公司；计算机辅助精子分析系统（Computer-Assisted Sperm Analysis,CASA）购自法国IMV（卡苏）；兽用Leja 八腔室玻片购自法国IMV（卡苏）。

1.4 基础稀释液BTS 配制 准确称取葡萄糖37.00 g、柠檬酸钠6.00 g、EDTA-2Na 1.25 g、碳酸氢钠1.25 g、氯化钾0.75 g、青霉素钾0.60 g、硫酸链霉素1.00 g，加双蒸水完全溶解后，pH 调至7.2，加双蒸水定容至1 L，4℃保存待用。

1.5 精液处理 使用CASA 上机确定精液稀释比例，使精子密度最终为1×10个/mL。将杜洛克猪精液按照稀释比例添加BTS 和CYS，使CYS 的终浓度分别为0、2、4、6、8 mmol/L，其中0 mmol/L 的CYS 作为对照组，分装于无菌离心管内，做好标记，用10 层纱布包裹后平铺置于17℃恒温箱中避光保存。保存期间每隔12 h轻微晃动精液，避免精子聚集沉淀致死。

1.6 精液品质检测 每隔24 h，取出精液样品，轻轻颠倒混匀后，取100 µL 于无菌离心管中，37℃水浴10 min，吸取2 μL 上机检测精子活力、渐进运动率，直至第7 天；在第3、5、7 天，采用低渗肿胀法检测精子质膜完整率，将100 μL 猪精液加入1 mL 柠檬酸钠-果糖低渗溶液中，37℃水浴1 h，再取10 μL 猪精液置于400 倍光学显微镜下观察，计算弯尾精子数与精子总数的百分比；在第3、5、7 天，采用FITC-PNA 联合DAPI 检测精子顶体完整率，吸取20 μL 猪精液滴加在干净载玻片上，晾干后，无水甲醇固定10 min，分别滴加DAPI、FITC-PNA 进行染色，置于37℃恒温箱避光孵育30 min，孵育结束后，PBS 清洗3 遍，盖上盖玻片，在40×倒置荧光显微镜下观察，计算头部呈圆滑绿色荧光精子数与精子总数的百分比。

1.7 抗氧化能力检测 在BTS 中添加CYS 最佳浓度对杜洛克猪精液进行稀释并17℃保存，在第3、5、7 d 时分别检测猪精液的总抗氧化能力（T-AOC）水平、丙二醛（MDA）含量、及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。

1.8 统计分析 利用SPSS 22.0 软件进行单因素ANOVA分析，使用LSD 进行多重比较分析差异显著性，数据结果用平均值±标准误表示，<0.05 作为差异显著标准。

2 结果

2.1 不同浓度CYS 对17℃保存下杜洛克猪精液品质的影响

2.1.1 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子活力的影响 如表1 所示，2 mmol/L CYS 组在保存的3～7 d 精子活力高于其他处理组（<0.05）；4、6 mmol/L CYS 组在保存期间精子活力与对照组差异不显著；8 mmol/L CYS 组在保存1～7 d 精子活力低于其他处理组（<0.05）。

表1 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子活力的影响 %

2.1.2 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子前向运动率的影响由表2 可知，2 mmol/L CYS 组在保存第3、4 天精子前向运动率高于其他处理组（<0.05）；4、6 mmol/L CYS 组在保存的1～7 d 与对照组相比对精子前向运动率的影响不显著；8 mmol/L CYS 组在保存期间精子前向运动率低于其他处理组（<0.05）。

表2 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子前向运动率的影响 %

2.1.3 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子质膜完整率的影响通过低渗肿胀法检测精子质膜完整率，精子尾部弯曲情况见图1。从表3 可看出，2 mmol/L CYS 组在保存的第3、5、7 天精子质膜完整率高于对照组（<0.05）；4、6 mmol/L CYS 组在保存期间的精子质膜完整率与对照组相比无显著变化；与对照组相比，8 mmol/L CYS 组在保存第3 天的精子质膜完整率降低（<0.05），但在保存第5、7 天无显著变化。

表3 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子质膜完整率的影响 %

图1 低渗肿胀试验下杜洛克猪精子质膜

2.1.4 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子顶体完整率的影响 经FITC-PNA 联合DAPI 染色后，顶体完整精子头部会发出圆滑且明亮的绿色荧光，反之顶体破损精子头部则呈残缺绿色荧光或无荧光（图2）。由表4 可知，2 mmol/L CYS 组在保存第3、5、7 天的精子顶体完整率高于其他处理组（<0.05）；与对照组相比，4 mmol/L CYS 组在保存期间对精子顶体完整率的影响不显著，6 mmol/L CYS 组在保存第7 天的顶体完整率降低（<0.05），其他时间段对精子顶体完整率无显著影响；8 mmol/L CYS 组中精子顶体完整率在保存的第3、5、7 天低于对照组（<0.05）。

表4 不同浓度CYS 对杜洛克猪精子顶体完整率的影响 %

图2 FITC-PNA 联合DAPI 荧光染色下杜洛克猪精子顶体

2.2 CYS 对杜洛克猪精液抗氧化能力的影响

2.2.1 CYS 对杜洛克猪精液中T-AOC 水平的影响 从图3 可见，随着杜洛克猪精液保存时间延长，T-AOC水平逐渐降低。在保存的第3、5、7 天，添加CYS 后精液中T-AOC 水平均高于对照组（<0.05）。

图3 CYS 对杜洛克猪精液中T-AOC 水平的影响

2.2.2 CYS 对杜洛克猪精液中MDA 含量的影响 如图4 所示，在保存的第3、5、7 天，添加CYS 后杜洛克猪精液中MDA 含量与对照组相比均降低（<0.05）。

图4 CYS 对杜洛克猪精液中MDA 含量的影响

2.2.3 CYS 对杜洛克猪精液中GSH-PX 活性的影响 从图5 可看出，在保存的第3、5、7 天，添加CYS 后杜洛克猪精液中GSH-Px 活性与对照组相比升高（<0.05）。

图5 CYS 对杜洛克猪精液中GSH-Px 活性的影响

3 讨 论

猪精液保存过程中易受多种因素影响而产生过量ROS。ROS 大量累积会对猪精子造成一系列不利影响，包括损伤DNA 结构，削弱精子的受精能力；使蛋白质受损，引起肽链断裂、构象及免疫原性改变；破坏生物膜的完整，改变膜通透性、降低膜流动性、增加膜脆性。CYS 作为含巯基氨基酸，具有较强还原性，已广泛运用于医疗药品、食品保存及动物饲料等行业。在猪精液稀释液中添加适宜浓度的外源性抗氧化剂可有效清除精液中的ROS，对改善保存后精液品质具有重要意义。

精子活力和前向运动率是精子运动性能参数中最具代表意义的两个指标，二者与公猪繁殖性能之间呈正相关。本实验发现，17℃保存至第7 天时，添加浓度为2 mmol/L 的CYS 组杜洛克猪精子活力和前向运动率仍然维持在71.06% 和74.36%。Zhu 等研究表明CYS 可降低精子DNA 氧化损伤生物标志物8-羟基脱氧鸟苷的百分比，保护兔精子DNA 结构，提高精子活力。由此推测，CYS 通过断裂自身的-SH 键与氧自由基相结合，降低氧自由基与精子DNA 结合机率，避免DNA 链片段化，进而保证精子DNA 结构的完整，提高精子活力和前向运动率。

由于猪精子生物膜上富含长链多不饱和脂肪酸，其质膜和顶体在保存过程中易发生脂质过氧化，造成精子运动能力下降，甚至活力丧失，最终引起精卵结合受阻。本实验中，添加2 mmol/L 的CYS 对17℃保存的杜洛克猪精子质膜和顶体的保护作用最佳，在保存第7 天，与对照组相比，2 mmol/L CYS 组的猪精子质膜完整率、顶体完整率分别显著提高12.15%、5.07%，这与范楚宁的研究结果相似，即添加CYS 能够维持獭兔精子质膜和顶体完整性。原因可能是CYS 的主要活性基团是具有还原性的巯基，可以避免细胞膜上的长链不饱和脂肪酸被氧化，保护细胞膜的完整，同时它还能够在细胞膜的蛋白质与蛋白质之间或者蛋白质分子内部形成二硫键，增强蛋白质结构的稳定性，从而提高杜洛克猪精子质膜完整率和顶体完整率，增强精子细胞膜抵抗脂质过氧化的能力。

T-AOC 水平、GSH-Px 活性以及MDA 含量是评估精液抗氧化能力的重要指标。史轶超等发现不育症患者精液中T-AOC 水平较正常男性精液明显降低，并表明低水平T-AOC 会造成精子运动能力下降。GSH-Px 是精液中重要抗氧化物酶，提高其活性后可有效缓解精子氧化损伤。MDA 作为脂质过氧化反应的主要代谢产物，MDA 含量越高，精子细胞膜氧化损伤越严重。本实验结果显示，添加2 mmol/L 的CYS 可以提高17℃保存下杜洛克猪精液中T-AOC 水平和GSH-Px 活性，降低精液中MDA 含量。这与程彩虹的研究结果相符，其发现半胱氨酸能够提高冷冻绵羊精液中抗氧化物酶活性，降低MDA 水平。CYS 可能通过牺牲自身还原性巯基直接与氧自由基结合，干扰ROS 产生，同时从促进谷胱甘肽合成，提高谷胱甘肽过氧化物酶活性，消除ROS 累积，以增强精液的抗氧化能力。

综上所述，在17℃保存条件下，添加适宜浓度的CYS 对杜洛克猪精子活力、渐进运动率、质膜完整率、顶体完整率和抗氧化能力具有积极作用，可能通过自身抗氧化活性及促进精子内谷胱甘肽的合成共同发挥抗氧化作用。

4 结 论

本实验结果证实，在17℃保存的杜洛克猪精液中添加CYS 能有效维持精液品质，其中以添加2 mmol/L的CYS 对猪精液保存效果最佳。该研究结果为CYS 作为抗氧化剂应用到猪精液17℃保存中提供理论依据，也为深入研究CYS 发挥保护作用机制奠定基础。