非洲猪瘟病毒LAMP 可视化检测方法的建立

卓泽文，刘树荣，李名志，王 宇，2，孔令保，2

（1.南昌市动物病毒与基因工程重点实验室，南昌 330045；2.江西农业大学生物科学与工程学院，南昌 330045）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的家猪、野猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率最高可达100%，且目前全世界没有有效的疫苗［1］。自2018 年8 月在沈阳发现中国首例非洲猪瘟病例以来［2］，中国大陆32 个省级行政区均已发生非洲猪瘟疫情［3］，对中国养猪业及其相关产业发展产生了巨大威胁，直接经济损失高达数百亿元。农业农村部发布的《非洲猪瘟疫情应急实施方案（2020 年第二版）》建议从生猪的生产养殖、调运、屠宰等环节建立检测监测，故ASFV 的现场、快速、灵敏、准确检测是及时发现和控制非洲猪瘟疫情的关键。

ASFV 是一种大型的高度复杂的包膜双链闭合线性DNA 病毒［4］，p72编码基因位于遗传多样性极低的区域，是ASFV 株系分型的重要基因，因此是核酸检测的最佳靶基因之一［5，6］。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术自2000 年日本学者Notomi 等在《Nucleic Acids Research》上报道后，经过20 多年的发展，已经成为一项十分成熟的技术［7］。目前针对ASFV 的检测方法主要是核酸检测和抗体检测。在中国动物疫病预防控制中心OIE 参考实验室公布的非洲猪瘟现场快速检测试剂评价工作中，抗体检测试剂的敏感性只有60%～70%，而核酸检测试剂的敏感性达93%～100%。此外，抗体检测成本较高、再现性较差、操作复杂，很难在基层实验室和猪场推广使用；荧光定量PCR 等方法仍存在对检测设备有较高要求、用时较长等问题，不能满足于现场和基层实验室的快速检测。本研究基于LAMP 技术建立一种适合猪场和农户现场检测的高效、简便、准确、价格低廉的ASFV快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Bst 3.0 DNA 聚合酶及其缓冲液购自NEB 公司；甜菜碱购自Solarbio 公司；核酸电泳10×Loading buffer购自TaKaRa 公司；2k DNA Marker、核酸染料购自北京全式金生物技术有限公司；10 mmol/L dNTP 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖购自GenStar公司。

1.2 仪器设备

梯度PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司；凝胶成像分析系统购自上海勤翔科学仪器有限公司；琼脂糖水平电泳仪购自上海天能科技有限公司；掌上离心机购自大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。

1.3 模板及引物

模板为本实验室保藏的pCMV-ASFV-p72 质粒，将该质粒序列信息在NCBI 官网上进行BLAST比对，确定保守序列。将ASFVp72基因保守序列导入LAMP 引物在线设计软件Primer Explorer V5，设计并筛选出一组LAMP 引物，引物序列信息见表1。引物扩增核心区域167 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（长沙）合成。

表1 LAMP 引物序列信息

1.4 方法

Bst 3.0 DNA 聚合酶使用说明书推荐的LAMP 反应体系各成分终浓度为1×等温扩增缓冲液Ⅱ（含2 mmol/L MgSO4）、6 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、320 U/mL Bst 3.0 DNA 聚合酶、模板、ddH2O。以该体系为基础，以pCMV-ASFV-p72质粒为模板，ddH2O 为阴性对照，采取单因素试验，对反应温度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、dNTPs 浓度、Bst 3.0 DNA 聚合酶浓度等条件进行优化，使用20×钙黄绿素-MnCl2显色液（含1 mmol/L 钙黄绿素、10 mmol/L MnCl2）进行显色，建立可视化LAMP 检测方法。

1.4.1 反应条件优化 受梯度PCR 仪温度设置程序限制，无法以1 ℃为梯度设置温度梯度，因此设置的 温 度 梯 度 为63.0、64.2、64.9、66.0、67.0、68.3、69.0 ℃；甜菜碱终浓度梯度设置为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mol/L；Mg2+的终浓度梯度设置为2、4、6、8、10、12 mmol/L；dNTPs 的终浓度梯度设置为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mmol/L；Bst 3.0 DNA聚合酶终浓度梯度设置为80、160、240、320、400、480 U/mL，反应结束后4 ℃冷却5 min，2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.4.2 LAMP 体系灵敏度试验 为检测LAMP 可视化检测方法的灵敏度，将pCMV-ASFV-p72 质粒稀释至107、106、105、104、103拷贝/μL 的模板溶液，加入优化后的LAMP体系至106、105、104、103、102拷贝/μL，使用20×钙黄绿素-MnCl2显色液（含1 mmol/L 钙黄绿素、10 mmol/L MnCl2）进行显色，检测体系灵敏度。

1.4.3 LAMP 体系特异性试验 以实验室保存的分别含有ASFV p72、ASFV p54、ASFV p30、乙脑病毒（JEV）NS1、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）N蛋白和猪流行性腹泻病毒（PEDV）N 蛋白编码基因的质粒为模板，加入优化后的LAMP 体系，使用20×钙黄绿素- MnCl2显色液进行显色，检测LAMP 体系特异性。

2 结果与分析

2.1 反应条件优化

如图1 所示，综合电泳条带亮度及各条带浓度比例分析可知，LAMP 反应的最佳温度为67.0 ℃，LAMP 反应体系的最佳甜菜碱终浓度为1.25 mol/L，最佳Mg2+终浓度为8 mmol/L，最佳dNTPs 终浓度为1.25 mmol/L，最佳Bst 3.0 DNA 聚合酶终浓度为320 U/mL。

图1 反应条件优化

综上所述，优化后的LAMP 反应体系各成分终浓度为1×等温扩增缓冲液Ⅱ（含2 mmol/L MgSO4）、6 mol/L MgSO4、1.25 mol/L 甜 菜 碱、1.25 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、320 U/mL Bst 3.0 DNA 聚合酶、1×钙黄绿素-MnCl2显色液、模板、ddH2O。

2.2 LAMP 体系的灵敏度

如图2 所示，当质粒模板浓度不低于103拷贝/μL 时，肉眼能够观察到体系发出的绿色荧光；当质粒模板浓度低于103拷贝/μL 时，肉眼不能观察到体系发出的绿色荧光。因此，优化后的LAMP 可视化检测方法灵敏度为103拷贝/μL 模板。

图2 灵敏度检测

2.3 LAMP 体系的特异性

如图3 所示，优化后的LAMP 可视化检测方法能成功检测出ASFVp72基因，而对ASFVp54基因、ASFVp30基 因、JEVNS1基 因、PRRSVN基 因、PEDVN基因等病毒基因无显色反应，具有良好的特异性。

图3 特异性检测

3 小结与讨论

非洲猪瘟是由非ASFV 引起的一种高传染性、高致死率的猪烈性传染病［1，8］。2020 年8 月农业农村部发布的《非洲猪瘟常态化防控技术指南（试行版）》指出，非洲猪瘟的防控形势依然复杂严峻。一是境外疫情输入风险持续存在。二是病毒分布广，没有明显的地区、季节差异，并已在部分野猪群中定殖，根除难度进一步加大。根据农业农村部公布的数据显示，与2017 年相比，2020 年底生猪出栏头数减少1.75 亿头，同比减少24.93%；猪肉产量减少0.13 亿t，同比减少24.56%，猪肉价格也因此一直高于非洲猪瘟疫情发生前。因此建立灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作简单的ASFV 现场检测方法，及时发现和处理疫病，对于防控非洲猪瘟至关重要。

LAMP 技术以其特异性强、灵敏度高、反应时间短、操作简单且鉴定便捷及时而受到研究人员青睐，目前已成功将该技术用于检测鉴定各类病原微生物、寄生虫、转基因成分、肿瘤、胚胎性别、食品过敏原等［9-11］。在针对ASFV 的检测方面，刘桂荣［12］针对ASFV 的B646L、E183L基因建立实时荧光LAMP 每管可检测出40 拷贝、分子信标LAMP 每管可检测出500 拷贝；王林等［13］依据商品化的荧光目视检测试剂盒建立针对p72基因建立的实时荧光LAMP 快速检测方法灵敏度为10 拷贝/μL；杨吉飞等［6］建立的可以检测到2 fg 的pGEM-T-vp72-E70 重组质粒，但没有进行可视化判定；韦莹华等［14］建立的Real-time LAMP 可在30 min 内检测低至100 拷贝/μL 的重组质粒；市面上部分qPCR 试剂盒灵敏度也在10～102拷贝/μL［15］。而本试验建立的LAMP 可视化检测方法可在60 min 内检测低至103拷贝/μL 的重组质粒，与常规PCR 的灵敏度持平或略微提高，进一步电泳结果表明，102拷贝/μL 的重组质粒能检测到但不足以进行显色反应，通过延长反应时间能进行显色反应。本试验采用的Bst 3.0 DNA 聚合酶不仅具有DNA 聚合酶活性，也具有高逆转录酶活性，能进行RT-LAMP 扩增，也能在样本不纯的情况下进行扩增；高彦萍等［16］使用Bst 3.0 DNA 聚合酶实现对马铃薯卷叶病毒的RT-LAMP 检测；Silva 等［17，18］使用Bst 3.0 DNA 聚合酶实现对寨卡病毒的RT-LAMP 检测，并证明RNA 酶抑制剂不影响Bst 3.0 DNA 聚合酶活性；因此本试验建立的LAMP 可视化检测方法不仅能够检测ASFV 基因组中的p72 序列，也能检测p72的mRNA，间接地提高了临床检测的灵敏度；考虑到质粒超螺旋构象与ASFV 基因组线性构象的差别，本试验建立的LAMP 可视化检测方法能适应基层和现场的检测要求。

综上所述，本试验基于环介导等温扩增（LAMP）技术，根据非洲猪瘟病毒p72基因保守序列设计一组LAMP 引物，采取单因素试验对LAMP 体系和反应条件进行优化，以钙黄绿素-MnCl2显色液进行可视化判定，灵敏度和特异性试验表明建立的LAMP 可视化检测方法具有很好的灵敏度和特异性。该方法较荧光定量PCR、ELISA 等检测方法对检测现场的仪器要求更低，仅需一个恒温水浴锅，反应时间更短，人员培训更简单，适合猪场和农户的现场检测。