肉羊屠宰场沙门菌的分离鉴定及其生物膜形成能力测定

冯雷喜，彭 斌，曹婉怡，姚 刚

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）

沙门菌是一种重要的人畜共患病病原菌，可通过屠畜的粪便、皮毛等污染胴体和加工环境，并能够在肉品接触表面形成生物膜，引起交叉污染。调查羊屠宰场沙门菌的流行及测定分离株成膜能力，可为沙门菌防控提供参考。王晶晶等［1］对肉牛屠宰场76 株沙门菌的成膜能力进行测定，结果显示全部菌株25 ℃和37 ℃下均能形成生物膜，沙门菌生物膜的安全风险较高。羊源沙门菌成膜能力的研究报道鲜见报道。本研究对新疆某肉羊屠宰场的沙门菌进行分离鉴定，并用结晶紫定量法对分离株生物膜能力进行测定，分析培养时间、温度对羊源沙门菌成膜能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

2019 年3—10 月在新疆乌鲁木齐市及其周边羊屠宰场采集各类样品共计1 389 份。用无菌生理盐水浸润的无菌棉签旋入羊肛门并刮取内容物，在羊胴体表面刮取以及于羊肠道内容物取样，将棉拭子插入含有5 mL 甘油肉汤的离心管中并标记，置于备有冰袋的泡沫盒中，12 h 内运回实验室。

四硫磺酸钠煌绿增菌液基础（TTB）、亚砷酸盐胱氨酸增菌液（SC）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、缓冲蛋白胨水（BPW）等均购于青岛日水生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 沙门菌分离鉴定 沙门菌检验按照国家标准方法（GB 4789.4—2016）挑取可疑菌落。

1.2.2 inv-A 鉴定 挑取平板上可疑单菌落于50 μL TE Buffer 的八连管内，置于PCR 仪95 ℃变性15 min，取出冰浴10 min，即DNA 模板，-20 ℃保存备用。利用PCR 技术对沙门菌DNA 片段进行扩增（保守基因inv-A）。将5 μL PCR 产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段由上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 沙门菌生物膜形成能力测定方法 将冻存菌株接种于BHI（pH=7.0）培养液中，于37 ℃培养18 h进行活化，2 次活化后在37 ℃培养液中随时间的推移对生物膜的形成进行测定。

生物膜的制备。用96 孔板结晶紫染色法，以阴性组均值加上其3 倍标准差为成膜标准，进行测定，OD＜OD 标准，为不成膜株；OD 标准＜OD＜2 OD标准，为弱成膜株；2 OD 标准＜OD＜3 OD 标准，为强成膜株。

1.3 试验设计

将沙门菌分离株在37 ℃条件下分别培养24、48、72 h 与4 、25、37 ℃温度下培养72 h 后对其成膜能力进行测定，分析培养时间和培养温度对成膜能力的影响。

1.4 数据处理

利用酶标仪测定样品OD，数据用平均值±标准偏差表示，采用统计分析软件GraphPad Prism 8.0.1进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 分离鉴定结果

2.1.1 培养基分离结果 在XLD 培养基上形成黑色有金属光泽的菌落（图1），BS 琼脂上形成有金属光泽的黑色菌落（图2），为疑似沙门菌。

图1 沙门菌菌落形态（XLD）

图2 沙门菌菌落形态（BS）

2.1.2invA鉴定结果 对疑似沙门菌分离株进行invA基因PCR 鉴定，结果显示54 株扩增得到约284 bp 的片段，与预期大小一致（图3）。

图3 部分样品invA 基因扩增鉴定结果

本研究从1 389 份样品中分离出54 株沙门菌，总分离率为3.89%。

2.2 沙门菌成膜鉴定结果

2.2.1 沙门菌37 ℃不同培养时间OD测定结果 54株试验沙门菌在37 ℃、72 h 培养下，其强成膜株、弱成膜株和不成膜菌株占比分别为55.56%、40.74%、3.70%；培 养48 h 占 比 分 别 为46.30%、50.00%、3.70%。培养24 h 占比分别为44.44%、44.44%、11.11%（表1）。沙门菌在37 ℃条件下经72 h 培养后OD最高，其成膜能力极显著高于48（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）；其中48 h 成膜能力显著高于24 h（P＜0.01）（图4）。37 ℃培养条件下，沙门菌成膜能力受时间的影响较大，且随时间增加成膜能力逐渐增强。

表1 37 ℃不同培养时间沙门菌成膜能力

图4 37 ℃培养不同时间生物膜形成能力

2.2.2 沙门菌72 h 下不同培养温度OD测定结果54 株试验沙门菌在4 ℃培养下，强成膜株、弱成膜株、不成膜菌株占比分别为29.63%、20.37%、50.00%；25 ℃培养下占比分别为62.96%、37.04%、0%。在37 ℃培养下占比分别为55.56%、40.74%、3.70%（表2）。 经72 h 培养，25 ℃培养条件下OD值最高，沙门菌分离株成膜能力极显著高于37（P＜0.001）、4℃（P＜0.001）；37 ℃和4 ℃条件下成膜能力差异不显著（P＞0.05）。

表2 72 h 下不同温度沙门菌成膜能力

图5 72 h 培养不同温度生物膜形成能力

3 讨论

3.1 沙门菌污染率调查分析

王晶晶等［1］研究发现，在四川部分地区山羊沙门菌检出率为54.59%；新疆石河子某羊场沙门菌检出率为51.5%［2］；储倩等［3］研究发现，某屠宰场沙门菌携带率为50%。吴美云［4］进行沙门菌的分离鉴定，检出率为10.9%；匡秀华［5］研究发现，分离率为25.12%。本研究发现，新疆部分屠宰场羊肉污染率为3.89%（54/1389），与国内报道食源性沙门菌结果差异较明显。中国不同地域、品种沙门菌均有分布，本研究虽检出率较低，但仍需加强对沙门菌的监测与预防。

3.2 37 ℃条件下不同培养时间沙门菌与生物膜形成能力的关系

本研究发现，在37 ℃培养条件下，不同培养时间沙门菌生物膜形成能力差异显著，且生物膜的形成能力会随着培养时间的增加而显著增强。这可能是由于细菌胞体表面的物理、化学特性，导致细菌与黏附表面的相互作用从而影响沙门菌的黏附和生物膜的形成［6］。

3.3 72 h 培养条件下不同温度沙门菌与生物膜形成能力的关系

本研究发现，25 ℃是沙门菌形成生物膜的最佳温度，生物膜形成能力最强，该结果对肉制品产业链以及检测机构有重要意义。结合生物膜测定结果，培养时间显著影响其成膜能力，与尹彬茹［7］研究结果一致。由于生物膜极易引起二次污染［8］，研究生物膜形成能力具有重要指导意义。有利条件可促使沙门菌的多细胞形态生成，在28 ℃下能够产生细聚合菌毛促进生物膜形成［9-11］。研究发现，沙门菌在37 ℃条件下生物膜形成能力一般［12］，本研究发现37 ℃条件下沙门菌形成生物膜的能力随时间增加逐渐增强。

4 小结

本研究中羊肉屠宰场中沙门菌检出率为3.89%（54/1389），存在一定程度的污染，需要加强对沙门菌的监测与预防。在中性（pH=7.0）环境中，沙门菌分离株经37 ℃培养随培养时间延长生物膜形成能力逐渐增强；经72 h培养条件下25 ℃时成膜能力最强。