获卵数及可移植囊胚数与PGT-M/PGT-SR助孕周期累积活产率的相关性研究

陈鑫，徐鸿毅，3，张鑫，邓锴，4，张昌军，4*

(1.湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心，十堰 442000；2.湖北省生殖医学临床医学研究中心，十堰 442000；3.湖北医药学院生物医药研究院，十堰 442000；4.湖北医药学院生物医学工程学院，十堰 442000)

胚胎植入前遗传学检测(PGT)是指在移植前对胚胎染色体进行检测，以排除携带遗传性疾病或染色体异常的胚胎，从而提高胚胎种植率、临床妊娠率和活产率。根据检测目标的不同，PGT分为胚胎植入前非整倍体筛查(PGT-A)、单基因疾病遗传学检测(PGT-M)和染色体结构重排检测(PGT-SR)[1]。随着胚胎遗传分析技术的不断发展，一系列诸如囊胚活检、比较基因组杂交以及高通量测序等高新技术的应用，PGT-M和PGT-SR已逐渐成为对携带单基因病和染色体结构重排等遗传易感性疾病的夫妇进行产前阻断的有效方法[2-3]。

在IVF助孕周期中，有研究表明获卵数与累积活产率之间有很强的相关性，是影响助孕结局的重要因素[4-5]。虽然这种关系不是线性的，但是在一定范围内，随着获卵数的增加，患者的累积活产率逐渐上升，因此获卵数可作为预测临床妊娠率的指标之一[6-7]。有研究结果显示，PGT助孕周期中卵母细胞数量与活检胚胎数量和可移植的胚胎数量显著相关，一定范围内增加获卵数可以增加患者每周期可活检的胚胎数，但同时会增加卵巢过度刺激的风险[8]。

IVF助孕周期中适度进行促排卵，既可以获得足够数量的优质卵母细胞，同时又可以降低卵巢过度刺激的发生风险，是目前国内外同行关注的焦点[9-10]。有关获卵数或可用胚胎数与活产率的研究大多是关于常规IVF助孕新鲜移植周期活产率的研究，而PGT-M和PGT-SR助孕周期中卵母细胞数量和可移植囊胚数量与累积活产率的相关性研究仍然鲜见。本研究通过回顾性分析PGT-M和PGT-SR助孕周期中不同获卵数和可移植囊胚数量与每个周期累积活产率的相关性等，来探讨PGT助孕周期理想的获卵数范围，指导临床医生制定个体化的促排卵方案，使患者一次取卵的获益最大化。

材料与方法

一、研究对象

以2016年1月至2020年12月因单基因疾病或染色体结构重排在湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心接受PGT助孕患者的临床资料为对象进行回顾性分析。

纳入标准：(1)夫妻双方至少一人经外周血染色体核型分析诊断为染色体结构异常携带者；(2)夫妻一方携带显性致病基因、夫妻双方都携带隐性基因，或者有特定遗传疾病家族史；(3)女方年龄20～40岁；(4)女方无子宫及卵巢病变。(5)符合2018年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》中PGT-M/SR可应用于单基因遗传病和染色体异常的适应证[11]。

排除标准：(1)卵巢储备功能下降；(2)子宫内膜异位症；(3)多囊卵巢综合征；(4)双侧输卵管积水。

本研究符合医学伦理学标准，经湖北医药学院附属人民医院伦理委员会讨论通过，经过充分的临床评估以及遗传咨询后，在夫妇双方自愿选择治疗方式的原则下签署ICSI和PGT的相关知情同意书。

二、研究方法

1.临床促排卵：根据女方经阴道B超下双侧卵巢的窦卵泡计数和各项检查报告评估卵巢功能并制定合适的促排卵方案。促排卵期间B超下动态监测卵泡生长情况以及血清激素水平，当主导卵泡平均直径达到20 mm时，给予人绒毛膜促性腺激素(HCG，2 000 U/支，珠海丽珠制药)1支及促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达必佳，0.1 mg/支，辉凌，德国)扳机，诱导卵母细胞成熟。扳机用药后34～38 h在经阴道B超引导下行卵泡穿刺取卵手术。

2.受精与胚胎培养：为了避免颗粒细胞及男方精子干扰胚胎检测结果，所有的卵母细胞均行卵胞浆内单精子注射(ICSI)授精，受精16～18 h后观察原核情况，见到原核确定为受精，见到两个原核确定为正常受精。授精后第3天参照“人类体外受精-胚胎移植实验室操作专家共识”[12]对胚胎进行评级，Ⅰ～Ⅱ级为优质胚胎，Ⅰ～Ⅲ级胚胎均为可用胚胎，IV级胚胎为废弃胚胎。全部的可用胚胎行囊胚培养到第5天或第6天。

3.囊胚活检与PGT检测：采用Gardner囊胚分级法对第5或第6天的囊胚进行评分分级[13]，选择评分3BB及以上的囊胚进行活检。在远离内细胞团处的透明带进行激光打孔后，取3～5个囊胚滋养层细胞进行检测，活检完的囊胚玻璃化冷冻保存。PGT检测在湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心完成，采用二代测序技术(NGS)进行检测，对活检的外滋养层细胞先进行全基因组扩增，再进行扩增产物文库构建，生物信息分析，对胚胎染色体是否存在异常进行诊断[14]。对单基因遗传病患者采用目标序列捕获测序，筛选出致病基因突变位点的单核苷酸多态性(SNP)单体型信息，同时对受检胚胎的SNP和突变点信息进行分析，实现染色体异常和单基因病的同时检测[15]。由具备PGT遗传咨询资质的人员根据检测结果确定胚胎是否可移植，若PGT检测结果为可移植胚胎，则进行复苏后移植，若为不可移植胚胎，则经患者夫妇知情同意签字确认后丢弃。

4.内膜准备与胚胎移植：冻融胚胎移植(FET)周期采用降调节联合激素替代方案进行内膜准备。于月经第3天检测性激素水平，如果性激素水平与月经周期相符，则给予肌注醋酸曲普瑞林(达菲林，辉凌制药，德国)3.75 mg，35 d后通过超声观察子宫内膜情况，达到降调节标准后开始给予戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)口服4 mg/d，连续服用5 d后调整为6 mg/d。第10天开始定期B超监测子宫内膜生长情况，根据内膜厚度及形态及时调整戊酸雌二醇剂量。当子宫内膜厚度≥7 mm时，肌肉注射黄体酮注射液(浙江仙琚制药)80 mg行内膜转化，5 d后行单囊胚解冻移植。胚胎移植后14 d测血β-HCG，若β-HCG>50 U/L则定义为HCG阳性。移植后30 d行阴道超声检查，若宫腔内可见妊娠囊，则定义为临床妊娠。由专职人员负责随访孕期各项指标、产前诊断结果和新生儿分娩情况等，随访率100%。

5.收集资料及主要观察指标：收集患者的一般临床资料，包括女方年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限，抗苗勒管激素(AMH)水平、基础窦卵泡数(AFC)；促排卵中基础激素水平、HCG日激素水平以及胚胎情况等各项指标。主要的观察指标包括：胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率、累积活产率等。本研究中累积活产率的计算参照2018年中国专家共识进行[16]，以单个取卵周期累积活产率进行计算。

胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/FET周期数×100%；早期流产率=确诊临床妊娠12周以前的流产周期数/临床妊娠周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；累积活产率=FET成功分娩周期数/取卵周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般情况及实验室结果

本研究共纳入307(268对夫妇)个周期，其中54个(17.59%)为单基因病检测(PGT-M)周期，253个(82.41%)为染色体重排检测(PGT-SR)周期。39对夫妇由于第1个取卵周期无可用胚胎接受了第2或第3个取卵周期。女性平均年龄为(30.14±4.16)岁，平均获卵数为(9.47±3.59)个，每个周期平均可活检囊胚数为(2.86±1.68)个(表1)。

表1 PGT-M/SR周期患者一般情况及实验室结局[(-±s)，%]

二、胚胎复苏后移植妊娠结局情况

本研究共有192个移植周期，其中127例(66.14%)胚胎成功着床，112例(58.33%)获得临床妊娠，8例(7.14%)在妊娠早期发生流产，4例(3.57%)异位妊娠，93例(53.14%)获得活产，1例(0.89%)因先天性畸形终止妊娠。共175个周期进行了完整的FET，累积活产率为53.14%(表2)。

表2 PGT-M/SR周期患者胚胎复苏后移植妊娠结局情况(%)

三、获卵数及可活检囊胚数与至少有1个可移植囊胚概率的关系

校正女方年龄、BMI、AMH及AFC后对患者获卵数、可活检囊胚数与至少有1个可移植囊胚的概率进行曲线拟合分析，结果显示：获卵数与至少有1个可移植囊胚的概率显著相关[RR=1.108，95%CI(0.976，1.227)，P=0.000]，随着获卵数的增多，可移植囊胚率逐渐增加(图1A)；同样，每周期可供活检的囊胚数与至少有1个可移植囊胚的概率显著相关[RR=1.155，95%CI(0.994，1.242)，P=0.000]，随着取卵周期可活检囊胚数的增加，有可移植囊胚率逐渐增加(图1B)。

A：获卵数；B：活检囊胚数；●示均值，○示相应值的95%CI。图1 每周期获卵数和可活检囊胚数与至少有一个可移植囊胚概率的关系

四、获卵数及可移植囊胚数与累积活产率的关系

校正女方年龄、BMI、AMH及AFC后，分析患者获卵数及可移植囊胚数与累积活产率之间的关系进行曲线拟合分析，结果显示：女方获卵数(图2A)和可移植囊胚数(图2B)对累积活产率有显著影响。随着获卵数的增加，累积活产率逐渐增加，最高可达83.33%，当获卵数≥10个时，累积活产率趋于平稳；随着患者每周期获得可移植囊胚数的增加，累积活产率逐渐增加，可移植囊胚数量≥5枚时，累积活产率趋于平稳。

A：获卵数；B：可移植囊胚数；●示均值，○示相应值的95%CI。图2 每周期获卵数及可移植囊胚数与累积活产率的关系

五、获卵数、可活检囊胚数、可移植囊胚数及累积活产率之间的相关性

将年龄作为协变量，使用泊松回归分析每取卵周期获卵数、可活检囊胚数量、可移植囊胚数及累积活产率之间的相关性，结果显示：在PGT-M/PGT-SR助孕周期中获卵数[OR=1.041，95%CI(0.883，1.211)，P=0.014]、可活检囊胚数[OR=1.167，95%CI(1.062，1.291)，P=0.012]和可移植囊胚数[OR=1.276，95%CI(1.111，1.409)，P=0.042]均与累积活产率显著相关(表3)。

表3 获卵数、可活检囊胚数、可移植囊胚数及累积活产率之间的相关性

讨 论

IVF妊娠结局受多种因素的影响，如卵母细胞数量，可用胚胎的数量，子宫内膜的容受性等，其中获卵数和胚胎质量是影响妊娠结局的重要因素[16-17]。获卵数偏低时，患者可利用胚胎数减少，导致周期取消率增加和累积妊娠率降低[18]。每周期取卵过多时会导致卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生风险增加，延长治疗周期时间，同时会增加患者的经济负担。有研究表明，在获卵数≥15个的患者中，中重度OHSS的发生率约为正常人群的6.8倍，过多的获卵数在增加OHSS风险的同时会出现卵母细胞利用率下降的现象，即可移植胚胎的数量并没有显著增多，患者的临床妊娠率没有显著提高[19-20]。

关于IVF助孕周期中最佳获卵数的探索，既往多项研究结果显示在新鲜胚胎移植周期和FET周期中，获卵数与累积活产结局之间有着显著的相关性，获卵数在适当范围内时可以获得理想的临床结局。Sunkara等[21]通过对40多万个IVF周期助孕结局进行了分析，结果显示获卵数为0～15个时，患者累积活产率随获卵数增加而逐渐升高，而当获卵数>15个时，活产率呈现出逐渐下降的趋势；在该预测模型中，年龄每增加1岁，则可活检囊胚数和可移植囊胚数分别减少3.5%和5.6%；获卵数是可活检囊胚数和可移植胚胎数的良好预测因素，也与累积活产率显著相关，卵母细胞数量增加1个，累积活产率增加6.0%。本研究在PGT-M/SR全组分析中发现每周期获卵数、可活检囊胚数及可移植囊胚数有显著的相关性。在校正女方年龄、BMI、AMH及AFC后，对患者获卵数、可活检囊胚数与至少有1个可移植囊胚进行曲线拟合分析结果显示，获卵数与至少有1个可移植囊胚的概率关系显著，随着获卵数的增多，可移植囊胚率逐渐增加；当获卵数>15时，接近100%有可移植囊胚。Vandervorst等[22]研究证实获卵数与可活检胚胎数及累积活产率呈正相关。本研究结果显示在PGT-M/SR助孕周期中每周期获卵数与累积活产率显著相关，每个取卵周期中获卵数增加1个，累积活产率增加4.1%，与之前研究相似。同时在本研究中，可活检囊胚数对可移植囊胚数有显著影响，即每增加1个可活检囊胚，至少有1个可移植囊胚的可能性增加15.5%，而每增加1个可移植囊胚，活产增加27.6%。进一步对PGT-M/SR进行亚组分析，结果显示每取卵周期获卵数、可活检囊胚数及可移植囊胚数之间均存在显著的相关性；可移植囊胚数与累积活产率之间存在显著的相关性，每周期增加1个可移植囊胚，累积活产率可以增加15%以上。因此，可活检囊胚数及可移植囊胚数量对PGT-M/SR助孕结局具有重要的影响。本研究中，囊胚活检、冻融移植后的累积活产率为53.14%，高于最新的欧洲生殖协会PGT指南报道的25%[23]。活产率较高可归因于纳入本研究中的患者仅为需要进行PGT-M和PGT-SR检测的患者，而排除了因复发性流产等需要进行PGT-A检测的患者，而这一部分患者即使在胚胎检测正常的情况下，也可能存在其他原因导致的胚胎无法着床或者流产的情况。

随着年龄的增长，卵巢储备功能下降是育龄女性选择辅助生殖助孕的重要原因之一。当这些卵巢储备功能下降的女性需要PGT-M/SR助孕时，经常会被告知卵巢对促排卵药物的反应性差、周期取消的风险高[24]。通过本研究结果分析，根据促排卵周期的卵母细胞数和囊胚数可预测累积活产概率。湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心数据分析结果显示，当获得10个卵母细胞时，至少有1个可移植囊胚的概率为62%；当患者有3个可移植囊胚时，累积活产率约为57%(未发表数据)。因此，对于卵巢储备功能减退的夫妇，可以进行多次促排卵周期以获得更多的卵母细胞、囊胚，并最终获得可移植囊胚进行移植。

本研究表明，PGT-M和PGT-SR助孕周期中，FET累积活产率与每取卵周期的获卵数、可活检囊胚数和可移植囊胚数显著相关。累积活产率随获卵数及可活检囊胚数的增加而逐渐上升；当每取卵周期获卵数≥10个或者可移植囊胚数≥5个时，患者的累积活产率趋于平稳，不再增加。鉴于大多数PGT中心采用了囊胚活检+冻融囊胚移植的方案，而FET周期可以有效地降低OHSS风险，因此采用更积极有效的卵巢刺激方法，把握卵巢刺激的强度，从多方面对获卵数进行调控，在有效性、安全性的前提下使可移植囊胚数量最大化，可以有效地提高患者的抱婴回家率。