基于多元统计分析的不同半夏种质资源中5种成分含量的比较研究

刘建桥，朱晓花，李三要※，管秋山，李燕骄，江世高，刘海华

（1.湖南省邵阳市草地资源保护中心/邵阳市南方草业科学研究所，湖南 邵阳 422000；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

半夏（Pinellia ternate）为多年生草本植物，块茎入药，已有2 000多年的药用历史。半夏为天南星科植物，具有燥湿化痰、降逆止呕的功能[1]。半夏喜阴凉湿润环境，多生于山坡、溪边阴湿的草丛或疏林[2]。

现代研究表明半夏的主要化学成分有有机酸类、生物碱、挥发油类、凝聚素、脂肪酸、脑苷脂、黄酮类、甾醇类、氨基酸、半夏蛋白和无机元素以及苯丙素类等[3-5]。半夏的生物碱含量很低，但被认为是具有药理作用的主要成分之一，半夏生物碱的主要成分为L-麻黄碱、葫芦巴碱、胆碱、鸟苷、胸苷、肌苷、尿苷和腺苷等[6]。核苷类成分是细胞维持生命活动的基本组成元素，具有改善人类健康和预防疾病的作用[7]。

主成分分析通过降维处理来达到简化原始数据指标的目的[8]。PLS-DA是一种无监督的模型识别方法，可寻找引起样品之间差异的变量[9]。聚类热图可从横向和纵向两个方面聚类反映样品的关系，还通过热图颜色的深浅来反映样品中相应成分含量大小[10]。灰色关联度分析和TOPSIS模型分析在中药材资源的质量综合评价方面运用广泛，多元统计分析可实现对中药质量更准确、更全面的分析。

因此，本实验以琥珀酸、盐酸麻黄碱、尿苷、鸟苷和腺苷为指标成分，建立同时测定半夏中5个成分的HPLC法，通过多元统计分析对14批不同产地半夏进行研究和评价，以期为半夏的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

仪器：Agilent1200高效液相色谱仪（配备紫外分光检测器）；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm 4.6 mm，5m）色谱柱；数显恒温水浴锅HH-8；万分之一电子天平CP224S；DHG-91012A型电热恒温鼓风干燥器；高速多功能粉碎机BJ-100型；紫外分光光度计UV-180；KQ-100TDE超声波清洗器；himac CF 16RX离心机；0.22m PALL进口滤头，0.45m津腾有机滤膜、水系滤膜和泰宁一次性注射器。

1.2 材料

甲醇、磷酸均为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯；琥珀酸（批号：Z18D6H7816）；盐酸麻黄碱（批号：171241-201508）；尿苷（批号：TM0313XA13）；鸟苷（批号：111977-201501）；腺苷（批号：KM0529CA14）对照品均购于源叶生物公司。14批半夏样品来源信息见表1，经邵阳市草地资源保护中心李三要研究员鉴定为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎。

表1 半夏样品信息Table 1 The information of thesample

表1 半夏样品信息Table 1 The information of thesample

编号Number来源Source生长状态Growth state编号Number来源Source生长状态Growth state X1 贵州威宁 栽培 X8 甘肃陇南 栽培X2 重庆丰都 栽培 X9 四川南充 野生X3 湖南张家界 野生 X10 四川遂宁 栽培X4 湖北襄阳 野生 X11 山西长治 栽培X5 河北安国 栽培 X12 山东临沂 野生X6 河北保定 栽培 X13 山东临沂 栽培X7 安徽滁州 栽培 X14 山东菏泽 栽培

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C1（8 250 mm 4.6 mm，5m）色谱柱；流动相：0.01 mol/L KH2PO（4 A）-甲醇（B），柱温：30℃；进样量20L，流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：210 nm；在张严方的方法基础上加以改进[11]，梯度洗脱为（0～5 min，12%B；5～15 min，12%～35%B；15～20 min，35%～100%B）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别称取琥珀酸、盐酸麻黄碱、尿苷、鸟苷和腺苷标准品30 mg、10 mg、20 mg、24 mg和16 mg，用超纯水溶解并定容至25 mL容量瓶中，摇匀，分别取2 mL制成浓度依次为240g/mL、80g/mL、160g/mL、192g/mL和128g/mL的混合标准液，作为储备母液，放4℃冰箱备用。

2.2.2 样品制备 将烘干的的半夏块茎样品打磨成粉后，取1.0 g半夏块茎粉末用10 mL超纯水超声提取2 h，5 000 r/min离心10 min，取其上清液，重复1次，后定容至25 mL容量瓶，备用，设置3个重复。

2.3 系统适应性

按2.1项色谱条件下，半夏5种化学成分分离很好，出峰时间适宜，灵敏度高，信噪比和理论塔板数均符合定量要求，色谱图见图1（标准品）和图2（样品），图中标号1-5分别代表琥珀酸、腺苷、尿苷、鸟苷和盐酸麻黄碱。

图1 标准品混标色谱图Fig.1 The chromatogram of the mixed standard

图2 半夏样品色谱图Fig.2 The chromatogram of the sample

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 将母液用超纯水逐步稀释制成1/2、1/4、1/8、1/16倍于混合母液的混合标品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以质量浓度作x轴，峰面积作y轴，绘制标准曲线，见表2。

表2 线性回归方程Table 2 Linear regression equation

2.4.2 稳定性试验 对同一份半夏样品在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h这7个时间点上样检测，结果（表3）表明半夏琥珀酸、腺苷、尿苷、鸟苷和盐酸麻黄碱这5个成分保留时间RSD（t）和峰面积RSD（a）分别为0.23%～0.71%、1.11%～1.22%，均符合稳定性要求，表明半夏样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.3 精密度试验 精密吸取半夏样品提取液，连续进样5次，结果（表3）表明半夏5种化学成分的保留时间RSD（t）为0.03%～0.10%，5种化学成分的峰面积RSD（a）为0.21%～0.62%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取半夏同一批次半夏样品5份，按照2.2.2项方法处理半夏样品后，上样检测，结果（表3）显示5种化学成分的保留时间RSD（t）为1.05%～2.11%，5种化学成分的峰面积RSD（a）为0.11%～1.27%，表明该方法重复性好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取半夏样品1.0 g，对已测得5种成分含量的同一批半夏供试品5份，分别精密加入一定量的各对照品母液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各成分加样回收率，结果（表3）显示加样平均回收率在87.12%～95.43%，其RSD值为0.22%～2.21%，均符合要求，回收率优良。

表3 方法学考察Table 3 The methodology verification

2.4.6 样品测定 取14批半夏样品溶液，按“2.1”项色谱条件进行检测，重复3次，计算样品中5种成分含量，分析结果见表4。

2.5 差异显著性分析

半夏5种成分含量测定结果见表4。从表4中可知半夏中琥珀酸含量为6.33～11.74 mg/g，盐酸麻黄碱含量为0.403～0.910 mg/g，尿苷含量为0.578～0.824 mg/g，鸟苷含量为0.333～0.919 mg/g，腺苷含量为0.072～0.186 mg/g。

表4 各成分含有量测定结果（mg/g）Table 4 Results of the content determination of various constituents(mg/g)

对14个不同产地半夏5种成分进行单因素方差分析Tukey HSD检验，从图3～图7中可以看出，5种成分含量差异均有极显著差异，其中X12地区的半夏琥珀酸含量极显著高于其他地区的半夏琥珀酸含量；X4-X11这7个地区的盐酸麻黄碱含量相对较高，是X1-X3这3个地区半夏盐酸麻黄碱含量的近2倍；X9地区的半夏尿苷含量最高，极显著高于其他地区的半夏尿苷含量；X6地区的半夏鸟苷含量最高，极显著高于其他地区的半夏尿苷含量；X3、X10-X13这5个地区的半夏腺苷含量相对较高。

图3 不同居群半夏琥珀酸含量差异Fig.3 Differences in succinic acid content of in different populations

图4 不同居群半夏盐酸麻黄碱含量差异Fig.4 Differences in the content of ephedrine hydrochloride in from different populations

图7 不同居群半夏腺苷含量差异Fig.7 Differences in adenosine content ofin different populations

图5 不同居群半夏尿苷含量差异Fig.5 Differences in the content of uridine in different populations

图6 不同居群半夏鸟甘含量差异Fig.6 Differences in guanosine content ofin different populations

2.6 灰色关联度与TOPSIS模型分析

灰色关联度与TOPSIS模型分析适合用于中药材质量的综合评价，灰色关联度可充分利用原始数据寻找整体上的规律性，TOPSIS法具有评估合理、应用灵活等优点[12,13]。参考孟杰等[12]对14个产地半夏的5种成分进行两种综合分析对比，从表5可知，两种不同参评方法的总体排序趋势基本一致，灰色关联度和DTOPSIS法的最大关联度差异分别为51.10%和99.24%，说明不同地区的半夏质量差异十分明显，而DTOPSIS法分析的最大关联度差异超过了95%，由此可以看出此处DTOPSIS法综合评价效果更好。对不同地区半夏品质综合评价的DTOPSIS法分析结果Ci排序为X12＞X14＞X13＞X1＞X6＞X8＞X11＞X7＞X2＞X5＞X10＞X4＞X3＞X9，对比两个排序，半夏质量最好的是X12，半夏质量最差的两个是X9和X3。

表5 不同产地样品灰色关联度和CiTable 5 Grey correlations and Ci of samples from different growing areas

2.7 主成分分析

主成分析方法（PCA）是一种监督模识别方法，可直观地从多维空间上表现不同样品间的成分差异。将14个不同居群半夏的5种成分构成一个整体txt数据集，采用主成分分析方法，提取前3个主成分，并绘制各样本的主成分得分图，从图8可知，不同居群半夏的PCA模型中84.6%变量被用来塑造3D模型的主要成分，PC1、PC2和PC3分别为43.3%、26.8%和14.5%，从PCA得分图中看到不同居群半夏有明显的品质区别，并各自聚集成群，可将不同地区的半夏样本明显区分成4个类别，X11、X12和X13聚为一类，X4、X7、X8、X9、X10和X14聚为一类，X6、X5聚为一类，X1、X2和X3聚为一类，反映出各个产地半夏的质量信息情况。

图8 样品主成分得分图（14 5数据集）Fig.8 The score plot of principal component analysis based on 14 5 data set

2.8 偏最小二乘判别分析

为了进一步发掘不同居群半夏样品成分的轮廓特征，采用偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）进行考察，该方法可以同时对数据集进行分类和特征提取。如下图9所示，在PLS-DA得分图上合计表征了原始变量65.4%的信息，主成分1为38.9%，主成分2为26.5%，从图中可以看出不同居群半夏样品位置分布较散，X8、X11、X12、X13和X14聚为一类，X9、X10聚为一类，X1、X3、X4、X6和X7聚为一类，X2、X5聚为一类，说明5种成分对不同居群半夏样本的分类起了关键作用。

图9 PLS-DA得分图Fig.9 The loading plot of PLS-DA

2.9 聚类分析热图

通过在MetaAnalyst软件中以平方Euclidean距离为度量标准，使用组间联接法绘制半夏14个样品的系统聚类树状图和热力图（图10），以直观展示各成分在不同居群半夏中的含量差异，各居群半夏样本的聚类分析显示，可将不同居群半夏划分为4个种类，X12、X11、X13、X10和X14聚为一类，X3、X1、和X2聚为一类，X4、X7和X8聚为一类、X9、X5和X6聚为一类。5种成分的聚类结果显示可以明显分为2个类群。类群（1）为琥珀酸和盐酸麻黄碱，类群（2）为尿苷、鸟苷和腺苷。热图颜色深浅可以代表含量的高低，从热图可以明显的看出X12颜色最深，X6、X14和X10颜色较深，琥珀酸中颜色最深的为X12，尿苷中颜色最深的为X9，即热图可以直观地体现不同样品各成分的差异。

图10 不同居群半夏的聚类分析及含量热图Fig.10 The cluster analysis and content heat map ofin different populations

3 讨论

3.1 提取工艺的选择

试验前期分别将甲醇、纯水和不同比例的甲醇-水作为提取溶剂进行超声提取，结果发现用纯水提取效率最高。对比提取时间（30 min、60 min和90 min）的效果，发现60 min和90 min的提取效率差异不显著，但均优于30 min，故选择60 min提取。

3.2 色谱条件的优化

比较了水-甲醇、水-乙腈、KH2PO4-甲醇、KH2PO4-乙腈等不同流动相对色谱峰的影响，发现KH2PO4-甲醇梯度洗脱的分离效果最佳，且能在12 min内实现分离测定，时间远低于前人的研究[2,14]，大幅度节约了分析成本，优化后的HPLC法简便快捷，可同时测定半夏琥珀酸、盐酸麻黄碱、尿苷、鸟苷和腺苷5种重要成分，可用来对大批量的半夏种质资源进行质量评价。

3.3 成分测定结果分析

用SPSS软件进行单因素方差分析，发现生长环境的不同对半夏中5种成分含量影响极显著，用MetaboAnalyst5.0软件进行PCA、PLS-DA和聚类热图分析，14批半夏样品均可聚为4类，用Excel 2010软件对数据进行灰色关联度分析和TOPSIS模型分析，发现山东临沂野生品种（X12）的综合得分最高，而其他3种野生品种X3、X4和X9综合评分较低；无论从单一成分还是整体来看，野生品种和栽培品种的5种含量差异没有表现明显差异性，说明半夏这5种成分含量与野生还是栽培无明显相关性；研究还发现综合评分较高的X12、X13、X14、X6和X8均为北方地区所产的半夏，这可能与南北地区的气候条件、降水差异存在较大的关系，后续会进行更深的一步试验来验证。

本研究建立的一测多评法可在12 min内同时测定半夏中琥珀酸、盐酸麻黄碱、尿苷、鸟苷和腺苷5种成分的含量，运用多元统计分析对半夏样品进行综合评价，主成分分析、偏最小二乘判别分析和聚类分析，结果显示，14组半夏样品均可分为4大类，但3种分析的4大类有一定区别，且主成分分析、偏最小二乘判别分析的主成分综合得分不能较好的体现出样品质量的优异性，故在单因素方差分析基础上，采用灰色关联度与TOPSIS模型分析来计算半夏各样品的综合得分，可以明显的显示出各个产地半夏样品的质量差异。

综上所述，本研究建立的一测多评法可同时测定半夏中5种活性成分的含量，这对半夏质量更准确全面的控制提供了参考依据；在对半夏种质资源进行质量评价时，建议采用单因素方差分析和TOPSIS模型分析，即可体现出半夏的单个成分含量高低和样品的总体质量水平。