细胞和病毒活疫苗中支原体污染的PCR检测方法建立与应用

2022-04-14耿仁浩刘博王芳罗玉峰曲鸿飞范学政秦玉明丁家波许冠龙沈青春秦爱建

中国农业科学 2022年7期

耿仁浩，刘博，王芳，罗玉峰，曲鸿飞，范学政，秦玉明，丁家波，许冠龙，沈青春，秦爱建

耿仁浩1，2，刘博1，王芳1，罗玉峰1，曲鸿飞1，范学政1，秦玉明1，丁家波1，许冠龙1，沈青春1，秦爱建2

1中国兽医药品监察所，北京 100081；2扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009

【】在生物学研究及生物制品生产中易发生支原体污染，针对我国当前支原体检验方法在时效性和敏感性上的不足，建立一种简便快速、特异敏感的支原体检验PCR方法。从SILVA数据库下载包含全部细菌、古菌和真菌的核糖体rRNA小亚基（16S/18S, SSU）参考序列的库文件SILVA_123_SSURef，从中提取全部支原体序列，经去重复后得到181条（种）支原体（包括139个已分类的单一种类和42个未分类的支原体）的16S rRNA序列，经比对后选取高变区V6到V9为检测目标区段，设计筛选出表现最佳的检测引物，建立检测支原体的通用PCR方法。选取12种常见的支原体或2种甾原体作为待检样品对该PCR方法进行检测范围验证；取6种不同动物来源的常用传代细胞和3种常见细菌进行特异性验证；选取了5种最常见的支原体和1种甾原体进行敏感性试验；并将其与经典培养法一同对17批（种）动物病毒活疫苗（分别用于6种动物）和24份8种细胞培养物样本进行对比检测以评价其实际应用效果。建立了一种通用的支原体PCR检测方法，检测引物由2条上游引物（5′-GCAAARCTATRGARAYATAGYVGAG-3′和5′-GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3′）和1条下游引物（5′- CCARCTCYCATRGTKTGACGG-3′）组成，引物配比为3﹕1﹕4，最佳退火温度为56℃。采用该PCR方法对14个较常见的支原体种类进行检测，结果均能扩增出396—413 bp大小的特异性条带，表明该方法的检测范围符合检测要求；对6种动物传代细胞和3种常见细菌进行检测，结果均未扩增出特异性条带，表明其特异性良好；灵敏度测定结果表明该PCR方法的检测下限可达20—200 CCU的活菌，对应的核酸为1.5—15.0 pg；对共计17批病毒活疫苗和24份细胞样品的检测结果与培养法检测结果基本一致，表明本研究建立的支原体PCR检测方法与培养法有很好的一致性，而且敏感性更高。建立的支原体PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、简单快速，为细胞及病毒活疫苗中可能的支原体污染提供了一种准确可靠的快速检测方法。

细胞；病毒活疫苗；支原体；16S rRNA；PCR

0 引言

支原体污染是指由一类缺乏硬细胞壁、能通过除菌滤器的微生物污染细胞系、生物原材料及制品的现象，泛指柔膜体纲（Mollicutes）微生物污染，以支原体属成员为主，其次是甾原体属[1-3]。1956年人类首次在细胞培养中发现支原体污染问题[4]，其后在鸡胚、动物细胞、昆虫细胞及以这些基质生产的生物制品中陆续发现[5]。赵翔等[6]在2003—2017年间对不同生产或研发单位送检的多种生物样本进行了支原体检查，几乎每年都会发现支原体污染样本。【研究意义】大多数支原体种类对人或动物有一定的致病性，因此病毒活疫苗或生物活性制品中污染支原体还会产生一定生物安全风险[7]。支原体是各种医用或兽用活疫苗、生物活性制剂及细胞的质量标准中的重要检验项目，在《中国药典》（2020版）和《中国兽药典》（2015版）中均有详细规定[8-9]，两部药典均采用了支原体培养法，但该方法有诸多弊端，如检测周期长达30日、敏感性差、受培养基质量和培养条件等影响较大等。因此，生物制品行业急需一种简便快速、准确适用的支原体检测方法。【前人研究进展】支原体的检测方法主要包括常规分离培养法、DNA染色法、酶联免疫吸附试验、PCR技术。其中DNA染色法被《中国药典》列为第二种可选方法，检验周期缩短为4—15 d。该方法原理是对吸附在细胞表面的支原体进行核酸染色，特异性较差，通常作为辅助方法使用[5,10-11]，LIGASOVÁ等[12]建立了一种使用荧光显微镜检测支原体的方法，相比于传统的DNA染色法提高了敏感性，但特异性上没有明显改善；酶联免疫吸附试验采用抗体夹心法检测支原体污染，特异性和灵敏性良好，但可被检测的支原体种类范围较窄[13-15]；核酸杂交技术主要见于一些较早期的文献报道[16-18]。PCR检测方法因其快速、准确、敏感和特异性好的特点[19-22]，成为当前应用最多的支原体快速检测方法，部分机构也开发出了一些商品化检测试剂，能很好地检测到部分支原体种类[23-26]。【本研究切入点】本研究针对上述问题，拟以更科学的引物设计方法为突破点，研究一种可检测当前所有支原体的通用PCR检测方法。16S rRNA是细菌特有的分子标记，不存在于真核生物细胞中，被广泛应用于细菌的分类和鉴定[27-29]。其全长约1 500 bp，含有9个明显的高变区（V1—V9区），这些高变区具有较强的种属特异性，并作为物种分类依据应用于微生物群落的扩增子分析[30-31]。本研究从SILVA数据库中下载了含有716.8万条16S rRNA序列的SILVA_123_SSURef库文件，使用Python程序从中提取和去重复后获得全部种类的支原体16S rRNA序列。通过序列比对后设计筛选支原体通用引物，优化反应条件后建立检测支原体污染的PCR方法。【拟解决的关键问题】建立一种简便、快速、准确、适用的支原体PCR检测方法，以部分替代或作为当前生物制品和细胞中支原体检验方法的补充，解决当前支原体检验的时效性、准确性和敏感性方面的问题。

1 材料与方法

1.1 菌株和细胞

支原体菌种：绵羊肺炎支原体（CVCC380）、衣阿华支原体（CVCC364）、精氨酸支原体（CVCC346）、口腔支原体（CVCC379）、莱氏无胆甾原体（CVCC2406）、惰性支原体（CVCC363），鸡毒支原体（CVCC353）、鸡滑液支原体（CVCC385）、猪鼻支原体（CVCC361）、猪肺炎支原体（CVCC4049）、牛支原体XBY01株、人型支原体HB1株、无黄无胆甾原体338株、鸭支原体BSJ52株。细菌：沙门氏菌（CVCC2139）、产气荚膜梭菌（CVCC1125）、大肠杆菌DH5α。健康细胞：非洲绿猴胚胎肾细胞（Marc145）（CVCCCL32）、非洲绿猴肾细胞（Vero）（CVCC CL28）、鸡胚成纤维细胞（CEF）、昆虫细胞（Sf9）、猪睾丸细胞（ST）、昆虫细胞（HighFive）、牛肾细胞（MDBK）、鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）。待检样品：人乳腺癌细胞（BT）、猪肾细胞（PK15）、小型猪肾细胞（MPK）、猴胚胎肾细胞（MA104）、鼠杂交瘤细胞CA3T3株、仓鼠肾成纤维细胞（BHK21）、ST、MDBK等细胞和14个品种活疫苗样本（包括鸡、鸭、鹅、猪、犬和草鱼用活疫苗）。

以上材料中，除大肠杆菌DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司，待检细胞来自国内多家实验室外，其余所有材料来自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂

Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM培养基、MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；PPOL肉汤、水解乳蛋白、琼脂糖购自BD公司；支原体检验培养基购自北京中海生物科技有限公司。

1.3 试验时间和地点

本研究实施时间为2019年3月至2020年8月，地点位于北京市大兴区庆丰路33号中国兽医药监察所。

1.4 引物设计

通过从Silva数据库（https://www.arb-silva.de/）下载SILVA_123_SSURef的16S rRNA数据库，共716.8万条16S rRNA序列，使用Python程序从中提取和去重复获得支原体16S rRNA序列共计181条，包括139个种类的支原体和42个未分类的支原体16S rRNA序列。甾原体的16S rRNA序列在NCBI上仅有莱氏无胆甾原体PG-8A一株的序列。加入一条大肠杆菌16S rRNA序列（作为参比序列），使用Lasergene 7.0中MegAlign软件进行序列比对。选取高变区V6到V9为检测目标区段，设计并筛选得到最佳的检测引物，包括2条上游引物MF20.1和MF20.2、1条下游引物MR21，其中MF20.1/MR21用于检测支原体类，MF20.2/MR21检测甾原体类，扩增产物大小为396—413bp，引物序列和结合区域如图1所示。

图1 支原体和甾原体的16S rRNA基因序列比对结果及特异引物结合区域

1.5 样品核酸提取

取1 mL支原体、细菌、待检细胞和疫苗样本，参照天根生化DNA提取试剂盒说明说书进行核酸提取，核酸终体积为100 μL。

1.6 引物的验证

对猪鼻支原体（CVCC361）、鸡毒支原体（CVCC353）、口腔支原体（CVCC379）、莱氏无胆甾原体（CVCC2406）等14种支原体或甾原体和健康细胞Marc145以及大肠杆菌进行PCR扩增。总反应体系为20 μL，包括2×Taq PCR Mix 10 μL、上下游引物（MF20.1/MF20.2/MR21，浓度比3﹕1﹕4，总浓度20 μmol·L-1）2 μL、dd H2O 6 μL以及2 μL模板DNA。反应条件为：95℃/2 min后，95℃/30 s、55℃/30 s、72℃/40 s进行35个循环后，72℃延伸3 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观察电泳结果。

1.7 退火温度的优化

以鸡毒支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体、大肠杆菌、Marc145细胞的核酸为模板，使用引物MF20.1/ MF20.2/MR21分别用不同的退火温度进行PCR试验。反应体系同1.6，反应条件为：95℃/2 min后，95℃/30 s、53—58℃/30 s、72℃/40 s进行35个循环后，72℃延伸3 min，以确定最适退火温度。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察电泳结果。

1.8 特异性试验

以MDBK、CEF、Sf9、Marc145、ST、SP2/0等6种常用的动物细胞和大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌等3种常见细菌培养物，按1.5的方法提取核酸，使用1.6的反应体系及优化的反应条件进行PCR扩增，并设立阳性对照和阴性对照。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察电泳结果。

1.9 敏感性试验

对鸡毒支原体、猪鼻支原体、衣阿华支原体、精氨酸支原体、口腔支原体、莱氏无胆甾原体等6种支原体培养物进行活菌计数，结果均为108CCU/ml。各取1ml培养物按照1.5的方法进行DNA提取，再用TE溶液对DNA进行10倍比稀释至10-6后，使用1.6的反应体系及优化后的反应条件进行敏感性试验。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察电泳结果。

1.10 支原体PCR检测方法的应用和比较

对中国兽医药品监察所保存的8种健康细胞（Vero、CEF、Sf9、Mac145、ST、HighFive、鼠源杂交瘤细胞、LMH）和16株其他实验室送检的BT、PK15、MPK、ST、CA3T3、BHK21、MA104、MDBK细胞以及17批动物疫苗样品，使用以上支原体PCR检测方法进行检验。同时对以上样品按照《中国兽药典》2015版使用培养法进行支原体检测，比较两种方法的符合度。将PCR阳性扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并将测序结果上传至NCBI进行BLAST比对。

2 结果

2.1 引物验证

鸡毒支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾原体、口腔支原体等14种支原体核酸扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。结果显示，14种支原体均有良好的特异性扩增条带，而大肠杆菌和Marc145细胞的扩增产物均为阴性，表明引物MF20.1/MF20.2/ MR21可作为支原体PCR检测引物。

2.2 退火温度优化

退火温度为53—56℃时，对鸡毒支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体3种支原体核酸均有良好的特异性扩增，57—58℃时，扩展产物条带亮度明显下降，大肠杆菌和Marc145细胞的核酸均无明显的扩增条带，如图3，因此确定56℃作为支原体PCR检测体系的退火温度。

a-f：分别为退火温度53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的PCR检测结果。M：DL2000 Marker；1：鸡毒支原体；2：鸡滑液支原体；3：猪鼻支原体；4：大肠杆菌；5：非洲绿猴胚胎肾细胞

2.3 特异性试验

6种不同动物来源的常用细胞和3种常见细菌的核酸，经支原体PCR检测方法扩增，结果均无特异性条带，如图4，表明该PCR检测方法特异性良好。

试验的PCR阳性对照选用的是口腔支原体（CVCC379），对其PCR产物链接T载体后进行了序列分析，结果如图5。将其上传NCBI网站进行blast比对，其与口腔支原体NCTC10112株相匹配部分（33—397 bp）同源性为99.45%。

2.4 敏感性试验

鸡毒支原体、猪鼻支原体、衣阿华支原体、精氨酸支原体、口腔支原体、莱氏无胆甾原体6种支原体提取核酸后，测定其浓度分别为75.9、83.2、77.3、68.9、82.5和63.3 µg·mL-1。1%凝胶电泳显示，将6种支原体核酸稀释到10-4—10-5均能扩增出396—413 bp大小特异性条带（图6）。由此可见，使用引物MF20.1/MF20.2/MR21在上述反应条件下，对支原体的检测敏感性良好。以上支原体的培养物活菌数均为108CCU·mL-1，则该PCR方法的检测下限可达到20—200 CCU，对应支原体核酸检测下限估值为1.5— 15.0 pg，考虑基因组大小的因素，敏感性与一些多重PCR方法相当[32-33]。

1：DL2000 Marker；2：阳性对照；3：阴性对照；4：MDBK细胞；5：CEF细胞；6： Sf9细胞；7：Marc145细胞；8：ST细胞；9：SP2/0细胞；10：大肠杆菌DH5α；11：沙门氏菌（CVCC2139）；12：产气荚膜梭菌（CVCC1125）

图5 阳性对照扩增产物测序

1、8、15：DL2000Marker；图a，2—7：鸡毒支原体10-1— -6倍稀释；9—14：猪鼻支原体10-1— -6倍稀释；16—21：衣阿华支原体10-1— -6倍稀释。图b：2—7：精氨酸支原体10-1— -6倍稀释；9—14：口腔支原体10-1— -6倍稀释；16—21：莱氏无胆甾原体10-1— -6倍稀释

2.5 PCR检测方法应用和比较

8种健康细胞均为支原体检验阴性；其他实验室送检的8种16株细胞中小鼠杂交瘤细胞CA3T3株、ST（F20）、MA104（F08）、MA104（F25）、MA104（F25 2008）、MA104（F29）共6株能扩增出396—413 bp大小特异性条带。培养法只检测出ST（F20）、MA104（F08）、MA104（F25 2008）、MA104（F29）等4株阳性，其余为阴性，结果详见表1。

对MA104（F25）和MA104（F08）细胞10 mL经10 000×离心20 min，取沉淀再次用《中国兽药典》2015版培养法检测，结果为阳性，表明该PCR检测方法的灵敏度高于培养法。取以上6株检测结果为阳性的PCR扩增产物送公司测序，NCBI上序列比对结果显示6种阳性产物均来自人口腔支原体，推测污染原因为低代次种细胞猴胚胎肾细胞MA104（F08）存在口腔支原体污染，导致高代次MA104细胞和同时操作的ST及杂交瘤细胞污染。

对10家国内兽药疫苗企业共计17批活疫苗样本（包括鸡、鸭、鹅、猪、犬和草鱼用活疫苗）同时采用培养法和PCR方法进行支原体检验，培养法结果均为阴性，PCR方法出现1批阳性结果，测序比对结果为鸡滑液支原体。17个疫苗品种的生产原材料包括了鸡胚、鸭胚和Vero、PK-15、ST、Marc145、MDCK及草鱼胚胎等细胞系，涵盖了常见生物制品的活性原材料，表明该PCR方法具有较广的适用范围。

表1 采用支原体检验PCR方法和传统培养法对检测兽用活疫苗的检测

a括号中表示经过离心浓缩后，再次用培养法检验的结果

aIt indicates that the data is got from a repeat test by cultivation method after centrifuge concentration of the samples

3 讨论

支原体污染是当前困扰生物相关的科研单位和企业的一个比较常见的问题，污染主要来源包括细胞和毒种，以及血清、鸡胚、原代细胞等动物性原材料和操作者本身。支原体污染可引起细胞生长抑制、DNA片段化及碳水化合物、核酸和蛋白质的合成受阻[34]，进而影响生物制品的质量，受支原体污染的细胞极难再净化，最经济的办法是无害化处理[35-36]。部分支原体种类对人和动物有致病性，存在一定的生物安全风险，因此，支原体检验也是生物制品行业规定的必检项目。

《中国药典》2020版和《中国兽药典》2015版的支原体检查法均采用了培养法[8-9]，能很好地检测生物制品或细胞中的支原体活菌，仍是当前公认的支原体检验金标准[1, 20]，但检测时效性差；《中国药典》的通则3301中支原体检验还规定了第二法——指示细胞培养法（DNA染色法）作为培养法的补充，检验周期为4—15日，原理是将供试品接种于指示细胞中培养富集后用特异荧光染料染色，如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。但有些支原体种类并不适应指示细胞培养物中生长，从而容易造成假阴性，死亡细胞释放出的核酸干扰结果观察而容易造成假阳性。药典方法的阳性对照均采用支原体活菌，容易成为污染源，因而不适于在细胞和病毒研究相关的实验室内进行。

相比药典规定的培养法和DNA染色法，支原体PCR方法无需使用支原体活菌样品作为阳性对照，从而杜绝了对照样品污染实验室的风险。PCR方法在检测到阳性样品后，可通过测序分析，进一步确认其是否为支原体核酸及污染支原体的种类，从而方便了支原体污染问题的快速溯源和解决，这是其他检测方法无法实现的优势。PCR方法于1993年首次应用于细胞的支原体污染检测[3, 37]，随后国内外学者对该类方法开展了各种研究试验并取得了良好的检测效果。

目前所发现的污染性“支原体”种类，医学领域主要包括6种支原体（分别为精氨酸支原体、人型支原体、猪鼻支原体、人口腔支原体、牛支原体和发酵支原体）和1种甾原体（莱氏无胆甾原体）[1]，考虑到兽医领域的应用，笔者在此基础上增加了7种，包括鸡毒支原体、猪肺炎支原体、绵羊肺炎支原体、衣阿华支原体、鸡滑液支原体、无黄无胆甾原和鸭支原体，共14个种类。本研究的是在保证良好的特异性同时，最大范围检测各种支原体，在通用检测引物设计筛选中引入较多的兼并碱基，并增加一条上游引物，扩增范围包括了现有全部支原体种类和甾原体，其中莱氏无胆甾原体和无黄无胆甾原体也被认为是生物制品支原体污染的重要种类[38]。当前建立的PCR方法从敏感性、特异性以及比对检测结果看，均达到较为满意的效果，但由于当前能获得的支原体和甾原体菌株仍不能覆盖所有种类，其他稀有种类支原体是否也能得到良好的扩增仍需试验验证。

关于生物制品中是否可以存在“死亡”支原体仍还有争议，传统培养法检测结果为阴性，而分子生物学或免疫学方法检测结果为阳性的样品，有可能是存在死亡的支原体，也有可能是培养法不能培养出该种类支原体。《中国药典》支原体检验第二法——指示细胞培养法（DNA染色法），采用先富集培养后染色，从而可以确保检测到的为活支原体，也有文献报道采用先培养富集后用PCR方法检测支原体活菌的方法[20, 23]。本研究建立的PCR方法未对样品中是否存在“死亡”支原体进行考虑，从严格的质量控制而言，有活性的生物制品或原材料就不应该检测出支原体成分。

自上世纪八十年代，我国对医用和兽用生物制品企业制订并执行了越来越严格的药品生产质量管理规范（Good Manufacture Practice, GMP）管理制度和相关法规，国内生物制品企业生产管理水平和生产条件不断提升，终产品中检出支原体污染的报道越来越少见[39]。从本研究的PCR检测方法应用和比较结果来看，兽用疫苗产品中出现1批PCR结果阳性而培养结果阴性，当前只能以培养法结果为准。在研究领域的实验室支原体污染问题不容乐观，本研究的应用部分的实验室细胞样品均来自国内具有一定技术水平的实验室，16株送检的待检细胞（8种）中6株结果阳性，支原体污染比例高达37.5%，尽管该结果只能代表少数实验室的情况，但也说明我国部分实验室控制支原体污染方面仍存在问题。实验室管理规范（Good Laboratory Practice，GLP），在我国又叫药物非临床研究质量管理规范，已在医药研究开发相关领域的实验室推行多年[40]，随着GLP未来在兽医及生物学研究领域的全面推行实施和检测技术的不断完善，支原体污染问题必将得到全面控制和有效解决。

4 结论

本研究建立的支原体PCR检测方法具有安全、快速、敏感高、特异强的特点，为生物学研究和生物制品生产等工作中免受支原体的干扰提供一种可靠的快速检测手段。

[1] UPHOFF C C, DREXLER H G. Detection of mycoplasma contaminations. Methods in Molecular Biology (Clifton, N J), 2013, 946: 1-13. doi:10.1007/978-1-62703-128-8_1.

[2] MEDVEDEVA E S, BARANOVA N B, MOUZYKANTOV A A, GRIGORIEVA T Y, DAVYDOVA M N, TRUSHIN M V, CHERNOVA O A, CHERNOV V M. Adaptation of mycoplasmas to antimicrobial agents:extracellular vesicles mediate the export of ciprofloxacin and a mutant gene related to the antibiotic target. The Scientific World Journal, 2014, 2014: 150615.

doi:10.1155/2014/150615.

[3] TEYSSOU R, POUTIERS F, SAILLARD C, GRAU O, LAIGRET F, BOVÉ J M, BÉBÉAR C. Detection of mollicute contamination in cell cultures by 16S rDNA amplification. Molecular and Cellular Probes, 1993, 7(3): 209-216. doi:10.1006/mcpr.1993.1030.

[4] ROBINSON L B, WICHELHAUSEN R H, ROIZMAN B. Contamination of human cell cultures by pleuropneumonialike organisms. Science, 1956, 124(3232): 1147-1148. doi:10.1126/science. 124.3232.1147.

[5] VOLOKHOV D V, GRAHAM L J, BRORSON K A, CHIZHIKOV V E.testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Molecular and Cellular Probes, 2011, 25(2/3): 69-77. doi:10.1016/j.mcp.2011.01. 002.

[6] 赵翔, 冯建平, 孟淑芳. 支原体检查的核酸检测方法及方法学验证的思考. 中国药事, 2018, 32(8): 1020-1027. doi:10.16153/j.1002- 7777.2018.08.003.

ZHAO X, FENG J P, MENG S F. Considerations ondetection by nucleic acid detection method and the methodological validation. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2018, 32(8): 1020-1027. doi:10.16153/j.1002-7777.2018.08.003. (in Chinese)

[7] ROTTEM S, BARILE M F. Beware of mycoplasmas. Trends in Biotechnology, 1993, 11(4): 143-151. doi:10.1016/0167-7799(93) 90089-R.

[8] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典-二部: 2015年版. 北京: 中国农业出版社, 2016.

Chinese Veterinary Pharmacopoeia Commission. Chinese Veterinary Pharmacopoeia of the People’s Repubilic of China. Vol 2015. Beijing: Chinese Agriculture Press, 2016. (in Chinese)

[9] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典-一部: 2020年版. 北京: 中国医药科技出版社, 2020.

Chinese pharmacopoeia commission. Chinese Pharmacopoeia of the People’s Repubilic of China. Vol 2020. The Medicine Science and Technology Press of China,2020. (in Chinese)

[10] DREXLER H G, UPHOFF C C.contamination of cell cultures. Encyclopedia of Cell Technology, 2003. doi:10.1002/ 0471250570.spi054.

[11] YOUNG L, SUNG J, STACEY G, MASTERS J R. Detection ofin cell cultures. Nature Protocols, 2010, 5(5): 929-934. doi:10.1038/nprot.2010.43.

[12] LIGASOVÁ A, VYDRŽALOVÁ M, BURIÁNOVÁ R, BRŮČKOVÁ L, VEČEŘOVÁ R, JANOŠŤÁKOVÁ A, KOBERNA K. A new sensitive method for the detection of mycoplasmas using fluorescence microscopy. Cells, 2019, 8(12): 1510. doi:10.3390/cells8121510.

[13] BAI Y, GAN Y, HUA L Z, NATHUES H, YANG H, WEI Y N, WU M, SHAO G Q, FENG Z X. Application of a sIgA-ELISA method for differentiation ofinfected from vaccinated pigs. Veterinary Microbiology, 2018, 223: 86-92. doi:10. 1016/j.vetmic.2018.07.023.

[14] QASEM J A, AL-MOUQATI S A, AL-ALI E M, BEN-HAJI A. Application of molecular and serological methods for rapid detection ofinfection (Avian mycoplasmosis). Pakistan Journal of Biological Sciences: PJBS, 2015, 18(2): 81-87. doi:10.3923/pjbs.2015.81.87.

[15] BEN ABDELMOUMEN MARDASSI B, BÉJAOUI A A, OUSSAEIF L, MLIK B, AMOUNA F. A recombinant antigen-based ELISA for the simultaneous differential serodiagnosis of,, andinfections. Avian Diseases, 2008, 52(2): 214-221. doi:10.1637/ 8071-071207-Reg.1.

[16] JOHANSSON K E, JOHANSSON I, GÖBEL U B. Evaluation of different hybridization procedures for the detection of mycoplasma contamination in cell cultures. Molecular and Cellular Probes, 1990, 4(1): 33-42. doi:10.1016/0890-8508(90)90037-Z.

[17] KONG H, VOLOKHOV D V, GEORGE J, IKONOMI P, CHANDLER D, ANDERSON C, CHIZHIKOV V. Application of cell culture enrichment for improving the sensitivity of mycoplasma detection methods based on nucleic acid amplification technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 77(1): 223-232. doi:10.1007/s00253-007- 1135-1.

[18] UPHOFF C C, DREXLER H G. Detecting mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction. Methods in Molecular Biology (Clifton, N J), 2011, 731: 93-103. doi:10.1007/978-1-61779- 080-5_8.

[19] 英聪, 王海光, 刘灿, 沈青春, 毕丁仁, 宁宜宝. 检测污染兽用疫苗14种支原体PCR方法的建立及应用. 中国预防兽医学报, 2014, 36(1): 42-45. doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2014.01.11.

YING C, WANG H G, LIU C, SHEN Q C, BI D R, NING Y B. The establishment of the PCR assay for detection of 14 kinds ofcontamination in veterinary vaccines. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2014, 36(1): 42-45. doi:10.3969/ j.issn.1008-0589.2014.01.11. (in Chinese)

[20] INGEBRITSON A L, GIBBS C P, TONG C, SRINIVAS G B. A PCR detection method for testing mycoplasma contamination of veterinary vaccines and biological products. Letters in Applied Microbiology, 2015, 60(2): 174-180. doi:10.1111/lam.12355.

[21] MBELO S, GAY V, BLANCHARD S, ABACHIN E, FALQUE S, LECHENET J, POULET H, DE SAINT-VIS B. Development of a highly sensitive PCR/DNA chip method to detect mycoplasmas in a veterinary modified live vaccine. Biologicals, 2018, 54: 22-27. doi:10.1016/j.biologicals.2018.05.002.

[22] 高广仁, 万玉林, 崔治亮, 葛玉凤, 刘学荣. 兽用生物制品中支原体污染PCR检测方法的建立与应用. 黑龙江畜牧兽医, 2018(15): 163-166. doi:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2017.12.0345.

GAO G R, WAN Y L, CUI Z L, GE Y F, LIU X R. Establishment and application of PCR for detection of mycoplasma contamination in veterinary biological products. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2018(15): 163-166. doi:10.13881/j.cnki.hljxmsy. 2017.12.0345. (in Chinese)

[23] ELDERING J A, FELTEN C, VEILLEUX C A, POTTS B J. Development of a PCR method for mycoplasma testing of Chinese hamster ovary cell cultures used in the manufacture of recombinant therapeutic proteins. Biologicals, 2004, 32(4): 183-193. doi:10.1016/ j.biologicals.2004.08.005.

[24] GRÓZNER D, SULYOK K M, KREIZINGER Z, RÓNAI Z, JÁNOSI S, TURCSÁNYI I, KÁROLYI H F, KOVÁCS Á B, KISS M J, VOLOKHOV D, GYURANECZ M. Detection of,,andsp. 1220 in waterfowl using species-specific PCR assays. PLoS One, 2019, 14(7): e0219071. doi:10.1371/journal.pone.0219071.

[25] WISSELINK H J, SMID B, PLATER J, RIDLEY A, ANDERSSON A M, ASPÁN A, POHJANVIRTA T, VÄHÄNIKKILÄ N, LARSEN H, HØGBERG J, COLIN A, TARDY F. A European interlaboratory trial to evaluate the performance of different PCR methods fordiagnosis. BMC Veterinary Research, 2019, 15(1): 86. doi:10.1186/s12917-019-1819-7.

[26] TOTTEN A H, LEAL S M Jr, RATLIFF A E, XIAO L, CRABB D M, WAITES K B. Evaluation of the ELITe InGenius PCR platform for detection of. Journal of Clinical Microbiology, 2019, 57(6): e00287-e00219. doi:10.1128/JCM.00287- 19.

[27] JEAN A, TARDY F, ALLATIF O, GROSJEAN I, BLANQUIER B, GERLIER D. Assessing mycoplasma contamination of cell cultures by qPCR using a set of universal primer pairs targeting a 1.5 kb fragment of 16S rRNA genes. PLoS One, 2017, 12(2): e0172358. doi:10.1371/journal.pone.0172358.

[28] BASCUÑANA C R, MATTSSON J G, BÖLSKE G, JOHANSSON K E. Characterization of the 16S rRNA genes fromsp. strain F38 and development of an identification system based on PCR. Journal of Bacteriology, 1994, 176(9): 2577-2586. doi:10.1128/jb.176. 9.2577-2586.1994.

[29] AMRAM E, MIKULA I, SCHNEE C, AYLING R D, NICHOLAS R A J, ROSALES R S, HARRUS S, LYSNYANSKY I. 16S rRNA gene mutations associated with decreased susceptibility to tetracycline in. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015, 59(2): 796-802. doi:10.1128/AAC.03876-14.

[30] BAKER G C, SMITH J J, COWAN D A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. Journal of Microbiological Methods, 2003, 55(3): 541-555. doi:10.1016/j.mimet.2003.08.009.

[31] BAHRAM M, ANSLAN S, HILDEBRAND F, BORK P, TEDERSOO L. Newly designed 16S rRNA metabarcoding primers amplify diverse and novel archaeal taxa from the environment. Environmental Microbiology Reports, 2019, 11(4): 487-494. doi:10.1111/1758-2229. 12684.

[32] 代玉立, 甘林, 滕振勇, 杨静民, 祁月月, 石妞妞, 陈福如, 杨秀娟. 玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法的建立与应用. 中国农业科学, 2020, 53(3): 527-538. doi:10.3864/j.issn.0578-1752. 2020.03.006.

DAI Y L, GAN L, TENG Z Y, YANG J M, QI Y Y, SHI N N, CHEN F R, YANG X J. Establishment and application of a multiple PCR method to detect mating types ofand. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(3): 527-538. doi:10. 3864/j.issn.0578-1752.2020.03.006. (in Chinese)

[33] 文静, 郭勇, 邱丽娟. 耐草甘膦转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系的建立及应用. 中国农业科学, 2020, 53(20): 4127-4136. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.20.003.

WEN J, GUO Y, QIU L J. Establishment and application of multipledetection system for glyphosate-tolerant gene/in soybean. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(20): 4127-4136. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.20.003. (in Chinese)

[34] NIKFARJAM L, FARZANEH P. Prevention and detection ofcontamination in cell culture. Cell Journal, 2012, 13(4): 203-212.

[35] UPHOFF C C, DREXLER H G. Eradication ofcontaminations from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology, 2014, 106: 28.5.1-28.512. doi:10.1002/0471142727.mb2805s106.

[36] UPHOFF C C, DREXLER H G. Eradication ofcontaminations. Basic Cell Culture Protocols, 2013946: 15-26. doi:10.1007/978-1-62703-128-8_2.

[37] UPHOFF C C, DREXLER H G. Detection of mycoplasma contaminations in cell cultures by PCR analysis. Human Cell, 1999, 12(4): 229-236.

[38] KONG F, JAMES G, GORDON S, ZELYNSKI A, GILBERT G L. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(7): 3195-3200. doi:10.1128/AEM.67.7.3195-3200.2001.

[39] 钱利武, 罗京京, 王浩, 刘小琼, 王慧. 药品GMP检查中质量控制与质量保证方面存在的主要问题及建议. 中国药事, 2020, 34(1): 17-21. doi:10.16153/j.1002-7777.2020.01.003.

QIAN L W, LUO J J, WANG H, LIU X Q, WANG H. Main problems of quality control and quality assurance in drug GMP inspection and the suggestions. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2020, 34(1): 17-21. doi:10.16153/j.1002-7777.2020.01.003. (in Chinese)

[40] 谢寅, 刘晓萌, 吕建军, 孟建华, 王秀文. 瑞士GLP法令与中国GLP规范的主要差异. 中国药事, 2016, 30(4): 352-354. doi:10. 16153/j.1002-7777.2016.04.008.

XIE Y, LIU X M, LÜ J J, MENG J H, WANG X W. Major differences between Swiss GLP articles and Chinese GLP. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2016, 30(4): 352-354. doi:10.16153/j.1002-7777.2016.04.008. (in Chinese)

Establishment and Application of PCR Assay for Mycoplasma Contamination in Cell Culture and Live Virus Vaccine

1China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081;2College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu

【】Mycoplasma contamination is prone to occur in biological research and productions. Aimed at the shortage of time-effectiveness and sensitivity of current Pharmacopoeia detection methods, a simple, rapid, specific and sensitive PCR method for mycoplasma was established.【】All the sequences of mycoplasmas were extracted from the datasets file SILVA_123_ SSUReffrom SILVA database, which contained aligned small (16S/18S, SSU) ribosomal RNA (rRNA) sequences for all three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya). 181 16S rRNA unique sequences of Mycoplasma (including 139 classified species and 42 unclassified Mycoplasma) were obtained by deduplication of the sequences. After alignment, the hypervariable regions V6 to V9 were selected as the detection target regions, and the detection primers were designed to establish a universal PCR method for mycoplasma detection. 12 kinds of mycoplasmas or 2 kinds of acholeplasmas were selected to verify the detection range of the PCR method; 6 kinds of passage cells from different animal and 3 kinds of common bacteria were selected for specific verification; 5 kinds of mycoplasmas and a kind of acholeplasma were selected for sensitivity test. In order to evaluate the performance of the assay in clinical application, 17 batches of animal live virus vaccines ( for 6 kinds of animals) and 24 samples of 8 kinds of cell cultures were subjected to test, which were compared with the classical culture method for mycoplasmas.【】A general PCR method for mycoplasma was established. The detection primers were composed of 2 upstream primers (5'-GCAAARCTATRGARAYA TAGYVGAG-3' and 5'- GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3') and a downstream primer (5'- CCARCTCYCATRGTKTGA CGG - 3'), and the mixing ratio of the primers was 3:1:4. The optimal annealing temperature was 56℃. The PCR method was used to detect 14 mycoplasma species, and the results showed that 396 bp-413 bp specific bands had been amplified, which indicated that the detection range of the PCR method satisfied the detection requirements; No specific bands were amplified from 6 kinds of animal cells and 3 kinds of common bacteria with the PCR assay. The results of sensitivity test showed that the detection limit of the PCR method was 20-200 CCU, and the corresponding nucleic acid was 1.5-15.0 pg. The detection results of 17 batches of live virus vaccines and 24 cell samples were almost consistent with those of culture method, which indicated that the PCR method established in this study was consistent with culture method well, and was more sensitive.【】The PCR assay established in this study was specific, sensitive, easy and fast, suitable for rapid detection of mycoplasma contamination in cells and live virus vaccine.

cell; live virus vaccine;; 16S rRNA; PCR