肺气肿动物模型研究进展

罗丽娟 陈燕

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以长期肺通气不足，持续慢性气道炎症导致肺组织破坏和肺功能下降为特点的慢性呼吸系统疾病。COPD的高发病率及病亡率，给患者和社会带来了巨大的负担[1-2]。COPD可由多种因素诱导，其发病机制非常复杂，包括蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化应激、炎症、细胞凋亡、免疫衰老异常等[3]。然而其具体的发病机制尚未完全阐明，通过建立有效的动物模型，有助于我们进一步了解和探索其生理和病理机制，为疾病的治疗与预防提供新思路及科学理论依据。肺气肿作为COPD的主要病理特征，一直是COPD发生机制的研究重点。为了探索COPD的病因和发病机制，许多学者对肺气肿的动物模型进行了相关研究。尽管这些模型仅模仿了COPD的某些特征，但它们对于进一步研究人类COPD的发病机制非常有意义。因此，笔者将着重对肺气肿动物模型研究进展进行阐述。

肺气肿动物模型的选择

目前，用于肺气肿的动物模型常见的有小鼠[4]与大鼠[5]，也有应用绵羊[6]、狗[7]、兔[8]、豚鼠[9]等来建模。动物模型可以在一定程度上反映人类疾病的病理和生理学特征。肺气肿的大多数特征，如炎性细胞聚集[10]、氧化应激[11]、细胞因子和蛋白酶的产生[12]、小气道和血管重塑[13]，以及肺功能下降[4]，可以在不同的模型中诱导。

小鼠用于构建肺气肿模型已被广泛研究，小鼠的基因组较其他动物与人类更为接近[14]，并具有相对较为广泛的基因、蛋白质序列、抗体可用性，且小鼠用于建模的成本较低，最重要的是，目前存在许多小鼠种属的可供研究选择，并且根据研究目的不同可构建特定的小鼠，从而更好地阐明某些特定基因在肺气肿发病中的作用。因此，小鼠被认为更适合肺气肿的实验研究。

大鼠的体积相对小，建模成本低，建模周期短，且基因组与人类相似。有研究指出，暴露于香烟烟雾(CS)仅2个月就可出现肺气肿的表现，这比豚鼠和小鼠的烟熏建模时间相对较短[15]。但大鼠也有其自身的局限性。大鼠的支气管分支很少，气管内纤毛分布较少，腺黏膜下腺体不成熟，气管黏膜下没有杯状细胞，且大鼠支气管炎症介质也与人类不同[16]。此外，研究者认为大鼠在建模过程会出现轻微的疾病，如果烟雾暴露过多，会产生非特异性颗粒过载效应[17]。

豚鼠建模具有许多优点，包括易于识别的肺气肿，比小鼠更明显的小气道重塑，以及气道中相当大的杯状细胞化生的发展[18]。研究指出，长期暴露于CS的豚鼠可出现肺部炎症、肺动脉血压升高和肺血管肌肉化、小气道重塑和肺气肿，并与肺功能改变(如阻力增加)相关[19-20]。其主要的缺点是成本高，且缺乏进行分子研究的工具，以及与豚鼠蛋白交叉反应的商业抗体数量有限。

肺气肿动物模型的制备

一、CS暴露诱发的肺气肿模型

根据临床统计，大约90%的COPD患者是吸烟者。吸烟是肺气肿的最重要危险因素之一[21]。长期接触CS的动物可能导致肺部炎症反应，其主要是由巨噬细胞刺激引起的，肺组织病理表现为支气管腔变窄，支气管软骨组织受损，导致肺泡破裂和(或)融合以及肺气肿的形成，这类似于人类对吸烟产生的反应[22]。CS暴露诱发的肺气肿可以尽可能模拟人类肺气肿的发病机理，为人类肺气肿的基础和临床研究提供基础。CS暴露方法因其成本低、操作简单、成功率高而被广大研究者接受，并且可以消除客观环境中的实验差异。肺气肿动物模型的CS暴露时间长短由于香烟种类不同，暴露方式、持续时间和频率不同，烟气密度不同，动物的物种和年龄不同而有所不同。

1.部分(仅鼻子或头部)暴露法：C57BL/6J小鼠通过鼻吸入CS， 2次/d，2支香烟/次，10支喷雾剂/香烟，5 d/周。暴露4个月后，小鼠肺组织病理结果表明肺泡随着吸烟时间的增加而增大。同时，吸烟小鼠肺组织中的B淋巴细胞增加，与人类肺气肿相似[23]。

2.全身暴露法：将实验动物作为一个整体放置在吸烟盒(装满烟的盒子)中。C57BL/6J小鼠暴露于CS中，每天吸烟3次，3支香烟/次。8周后，观察到肺部出现肺气肿样变化，并伴有肺泡巨噬细胞增多，细胞外基质变化和MMP-12表达增加[24]；或C57BL/6J小鼠每天吸烟2次，5支香烟/次，每周6天，暴露12周，观察小鼠肺组织出现肺泡腔增大、肺泡间隔变窄等病理变化[25]。

二、香烟烟雾提取物(cigarette-smoke-extract，CSE)腹腔注射诱导的肺气肿模型

既往研究者发现在小鼠腹腔内注射CSE可产生显著的肺气肿，假设CSE可以作为抗原，触发免疫反应引起肺气肿样改变，仅用了6周就成功建立肺气肿模型[26]。此外，有研究指出，腹膜内注射CSE构建肺气肿小鼠模型，建模结束后，对小鼠进行肺功能检测、收集血液，支气管肺泡灌洗液和肺组织形态学检测。结果表明，腹膜内注射CSE可导致肺功能下降、肺泡间隙增大、肺泡壁破坏、肺组织细胞凋亡、慢性肺部炎症、氧化应激水平增加等[4, 25, 27-30]。这种建模方法的有效性与CS暴露诱发的肺气肿动物模型有效性相当，相较于传统的CS暴露建模，腹腔注射CSE建模明显缩短了建模周期[25]。

在C57BL/6J或者BALB/c小鼠腹腔注射CSE(CSE制备：5支香烟溶于10 ml磷酸盐缓冲液里，经滤嘴过滤后使用，每次注射前现配现用)，建模为期4周。模型组在第1天、第11天、第22天进行CSE腹腔注射，对照组则注射生理盐水或磷酸盐缓冲液；第29天，建模结束，根据研究目的对小鼠进行相应的处理及收集样本[25]。

三、弹性蛋白酶诱导的肺气肿模型

气管内滴注弹性蛋白酶破坏了肺组织中蛋白酶-抗蛋白酶之间的平衡，不仅破坏了保护肺组织免受损伤的主要因素，而且还产生了大量的炎症因子，加速了肺泡壁的破裂与融合，从而诱发肺气肿。常用的弹性蛋白酶包括：木瓜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶(pig pancreatic elastinase，PPE)等。用弹性蛋白酶构建肺气肿动物模型的方法具有操作简单和建模周期较短等优点。因此，直接气管内滴入弹性蛋白酶是诱导肺气肿动物模型的常见有效方法之一。

木瓜蛋白酶是一种来自植物的蛋白水解酶，是最早用于诱导肺气肿模型的弹性蛋白酶。2 mg/kg木瓜蛋白酶溶液一次性经气管滴入建立稳定肺气肿模型，为期1周[31]。

PPE不仅可以充当蛋白酶来破坏蛋白酶-抗蛋白酶失衡，还可以作为氧化剂来诱导氧化应激，在二者共同作用下，动物模型中的肺泡显著增大。因此，PPE常被用来诱发肺气肿。PPE诱导途径主要包括气管内滴注、气管切开注射、雾化吸入。PPE浓度为0.6 IU左右，为期4～6周[32-34]。

四、化学物质刺激诱导的肺气肿模型

许多化学物质，包括NO2、脂多糖(LPS)、氯化铬(CdCl2)等都可能引起炎症和肺气肿。小鼠长期暴露于NO2(NO2体积分数20×106，每天14 h，持续25 d)后，通过促进氧化应激可引起小鼠肺气肿[35]；LPS(1 mg/kg的50 μl无菌生理盐水溶液稀释)主要通过刺激嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞引起气道和肺组织炎症，释放出一系列炎症介质，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)等，引发蛋白酶-蛋白酶失衡，最终发生肺气肿[36]。将0.5 ml 0.025% CdCl2溶液一次性滴入小鼠的气管中可以诱导出肺气肿的动物模型[37]。

表1 各种动物模型的优缺点

五、与基因相关诱导的肺气肿模型

随着分子生物学的发展，基因敲除诱导的肺气肿动物模型已被广泛用于肺气肿的研究。利用基因靶向和(或)转基因小鼠已经成为研究不同疾病的细胞和分子基础的主要技术方法。有研究指出，Abhd2基因敲除小鼠由于炎性细胞因子和蛋白酶基因的过度表达、巨噬细胞增多、细胞凋亡异常，以及缺乏对蛋白酶抑制剂的抵抗力，导致小鼠肺部出现肺气肿样变化[38]。并且这些改变与临床上肺气肿发生发展具有相似之处。血小板源性生长因子-β(PDGF-β)和TNF-α等可能干扰肺泡的正常发育，且既往研究发现，这些基因的过度表达可能破坏肺泡受损和修复两者之间的平衡，导致肺气肿的形成[39]。

上述5种肺气肿动物模型制备方法的优缺点具体见表1。

肺气肿动物模型的评价

建立动物模型之后，需要进行相应的评估以判断模型是否构建成功。常规检测指标包括肺功能指标、气道炎症指标、氧化应激指标和病理形态指标。肺功能指标包括记录气道阻力(Raw)、肺动态顺应性(Cdyn)、呼气峰流量(PEF)、吸气时间/呼气时间(Ti/Te)和血气分析[40-42]。气道炎症指标包括肺泡灌洗液细胞计数与分类、TGF-β、IL-6、IL-8、TNF-α等[4, 43]，以及弹性蛋白酶、组织蛋白酶和单核细胞趋化性蛋白1[44-45]。氧化应激指标包括超氧化物歧化酶(SOD)与活性氧(ROS)、核因子相关因子2[46-48]。病理形态学指标包括平均线性截距(MLI)、破坏性指数(DI)、凋亡指数(AI)和呼吸道的病理评分[27, 29, 49]。

肺气肿是肺实质的一种破坏性过程，其特征是终末细支气管远端的间隙永久性增大伴随肺泡壁的破坏[50]。成功的肺气肿动物模型表现为肺功能降低、炎症指标升高、氧化应激水平增加和肺组织结构破坏明显。然而，肺功能检测被认为不如形态学变化指标敏感，可能只在严重的气道重塑或肺实质破坏中检测到，而在轻度肺气肿动物模型中肺功能可能正常[18]。有研究者指出微观结构的定量评估是证明肺气肿改变存在的一种有效方法[51]。目前，尚无统一的标准去评判肺气肿模型。但是考虑到各种参数的可及性、客观性和稳定性，我们认为病理形态学指标(包括MLI、DI、AI)的变化是评估建立肺气肿动物模型的最重要参数。

总结与展望

吸烟是肺气肿发病最常见的危险因素。CS暴露被认为是构建肺气肿动物模型的传统方法。CS暴露引起的肺气肿可以模拟人类相对复杂的病理变化，被认为是目前最合理的肺气肿动物模型。但是，由于建模时间长，研究人员一直在探索新的建模方法。

迄今为止，还没有完美的实验性肺气肿动物模型与人类肺气肿的发病机理和特征完全一致。尽管小鼠和人类具有许多相似的生理过程，但是考虑到人类与小鼠之间在肺部结构、功能和免疫学方面的特定差异，两者之间也不尽相同。即使在小鼠体内，不同的种属对肺气肿的发展也表现出不同的敏感性。随着对肺气肿的研究不断深入，研究者提出了越来越多的替代诱导方法。因此，我们不仅应根据研究目的建立相应的肺气肿动物模型，还应通过多种建模方法探讨肺气肿的发病机制。随着科学技术的不断发展，相信未来将会有更合理和更规范的肺气肿动物模型应用于实验研究。

利益冲突声明所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献罗丽娟：论文选题和设计、起草及修改论文；陈燕：指导论文选题和设计以及修改论文