县级实验室应用结核分枝杆菌手工液体培养技术检测结果分析

邱勇 李蒙 屈榕 田发君

结核病是结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，诊断结核病最直接有效的方法就是从痰液中检测到结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[1-2]。目前，国内检测痰样本中MTB的方法以抗酸染色涂片和分枝杆菌培养法为主。抗酸染色涂片法简单方便，但阳性检出率低[3-4]。在培养法中，固体罗氏(L-J)培养法是目前国内最常用的方法，其阳性率较涂片高，但培养时间长，需要4～8周。虽然自动化液体培养报告阳性时间短于固体培养[5]，但其设备昂贵，通量高，不适合样本量较少的县级结核病实验室使用。手工液体培养法成本显著低于自动液体培养。本研究旨在采用分枝杆菌液体培养法(mycobacterium fast liquid medium，MFLM)进行手工液体培养与中和离心固体培养法进行比较，以评估手工液体培养法在结核病诊断中的应用价值。

资料和方法

一、材料

1. 标本来源：收集2018年7月1日至2020年12月31日在四川省武胜县疾病预防控制中心(简称“疾控中心”)结核病防治门诊就诊的疑似肺结核患者首次就诊时的痰标本。

2. 仪器与试剂：N-乙酰-L半胱氨酸NaOH(NaOH-NALC)前处理液、中性固体罗氏培养基、分枝杆菌液体培养管、分枝杆菌荧光检测仪(Myco Fast Ⅰ)均购自珠海贝索生物技术有限公司，离心机为Eppendorf Centrifuge 5810，仪器与试剂均由复旦大学基础医学院医学分子病毒学重点实验室提供。

二、研究方法

同时采用手工液体培养法和中和离心固体培养法对疑似患者的痰标本进行培养。具体步骤如下。

1. 标本留取：门诊就诊的疑似肺结核患者将即时痰、夜痰和晨痰送至疾控中心，工作人员在痰盒上标注患者信息，然后立即送至实验室进行检测。

2. 标本前处理和分离培养：将3份痰标本混合后取2～5 ml于50 ml带盖的尖底离心管中，先用2倍体积NaOH-NALC前处理液消化20 min，加入pH值为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)至50 ml，3000×g离心15 min，再弃上清液，沉淀用1 ml的pH值为6.8 PBS制备成约1.5 ml悬浊液；取1支MFLM培养管接种10滴(0.5 ml)悬浊液，取2支中性L-J培养管分别接种2滴(0.1 ml)悬浊液。2种培养管均置于37 ℃培养箱内培养。

3. 结果判定：按照《中国结核病防治工作技术指南》[6]和珠海贝索生物技术有限公司建议记录了每个样本的报告阳性时间。手工液体培养用分枝杆菌荧光检测仪进行判读，接种后第2、3、7天判读1次，以后每周判读2次，6周末仍为阴性，则表示培养结果为阴性[7]。固体培养用肉眼观察，接种后第3、7天观察1次，此后每周观察1次，8周末仍未见菌落生长为阴性[7]。对培养阳性标本进行抗酸染色，抗酸染色阳性则为阳性，接着用对硝基苯甲酸(PNB)生长试验进行菌种鉴定，抗酸染色阴性则判断为污染。对污染的液体培养物进行去污染处理(加入2倍NaOH-NALC消化20 min)后进行再培养，操作同上，若菌种鉴定结果为结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌即统计为最终培养阳性，否则记录为污染。

4. 菌种鉴定：使用PNB进行菌种鉴定。具体操作如下：(1)使用无菌吸管吸取生理盐水加1滴至磨菌瓶中，用接种环刮取菌落至磨菌瓶中，仔细研磨均匀；(2)向磨菌瓶中加入生理盐水，并通过加生理盐水与麦氏1号标准比浊度进行比较，调节浊度，直至与标准麦氏比浊管一致，即为1 mg/ml的菌液；(3)用标准接种环取2满环1 mg/ml的菌液，移至2 ml 准备的前处理管生理盐水中，即稀释成2～10 mg/ml菌液；(4)用标准接种环取1满环2～10 mg/ml菌液，用划线法均匀接种至鉴定培养基表面；(5)接种后培养基直立放于培养箱内，36 ℃培养；培养4周后报告结果。

5. 质量控制：阴性管不可重复使用；培养基、消化液等实验材料使用前检查是否在有效期内；实验室用水为仪器制备的UP等级水，经过高压蒸汽灭菌60 min，有效期为3 d。

三、统计学处理

采用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行数据资料的统计学分析。培养报告阳性时间等非正态分布的资料均以“M(Q1，Q3)”描述，运用χ2检验进行组间率的比较，通过一致性检验的Kappa系数来评价两种培养方法结果的一致性，培养报告阳性时间的比较采用Mann-WhitneyU检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两种培养方法的阳性率比较

本研究共纳入疑似肺结核患者1370例，对疑似患者的痰标本进行集菌法处理后分别进行中和离心固体培养和手工液体培养。结果显示中和离心固体培养法报告阳性标本274例，阳性率为20.0%(274/1370)。手工液体培养法报告阳性标本353例，阳性率为25.8%(353/1370)。手工液体培养法的阳性率高于中和离心固体培养法的阳性率，差异有统计学意义(χ2=12.907，P<0.001)，阳性率提高了28.8%。对两种培养方法的阳性和阴性结果进行一致性检验，Kappa系数为0.833(P<0.001)。两种培养方法的结果见表1。分别统计两种培养方法的污染情况。手工液体培养法共报告污染标本153例，其中11例经过去污染处理后再培养阳性，污染率为10.4%(142/1370)。中和离心固体培养报告污染标本144例，污染率为10.5%(144/1370)。

二、 两种培养方法非结核分枝杆菌检出率的比较

利用PNB对培养阳性的菌株进行菌种鉴定，两种培养方法共检出41例(non-tuberculous mycobacterium，NTM)，其中手工液体培养法检出38例，中和离心固体培养法只检出13例，前者比后者多检出25例，手工液体培养法检出NTM的能力显著高于中和离心固体培养法，差异有统计学意义(χ2=32.416，P<0.001)。

三、 两种培养方法报告阳性时间的比较

手工液体培养法的中位报告阳性时间为2(2，3)周，2周及以内报告阳性率为62.6%，4周及以内报告阳性率为94.9%，手工液体培养法在第2周报告阳性率最高，为38.8%(137/353)。中和离心固体培养法的中位报告阳性时间为3(2，4)周，3周及以内报告阳性率为66.1%，6周及以内报告阳性率为95.3%，中和离心固体培养法第3周报告阳性率最高，为38.7%(106/274)(表2)。手工液体培养法的报告阳性时间显著短于中和离心固体培养，差异有统计学意义(Z=-9.491，P<0.001)。

表2 两种培养方法报告阳性时间

讨 论

为了评估手工液体培养法在基层(县级)结核病实验室应用效果，笔者共纳入本单位收治的1370例疑似肺结核患者，对其痰标本分别进行手工液体培养法和中和离心固体培养法，结果显示手工液体培养法的阳性率更高，报告阳性时间更短，适合在基层实验室用于结核病的诊断。

手工液体培养法可以显著提高MTB的阳性检出率。在南非开展的一项研究通过收集疑似结核病患者的痰液进行培养，发现液体分枝杆菌培养管(mycobacterium growth indicator tube，MGIT)培养法相较于中和离心固体培养阳性率提高了30.3%(29.7%比22.8%)[8]。另一项在埃塞俄比亚进行的研究也发现，液体MGIT培养法的阳性率提高了30%(26%比20%)[9]。国内学者也开展了类似的研究，吴学兵等[10]在上海市松江区开展的研究发现，对疑似新发肺结核患者，液体MGIT培养法的阳性率为32.0%，中和离心固体培养法的阳性率为17.9%；王晓艳等[11]对确诊肺结核患者的研究发现，液体MGIT培养法的阳性率比简单固体培养高23.5%(57.2%比46.3%)。本研究结果与上述国内外研究一致，发现手工液体培养法的阳性率比中和离心固体培养法高28.8%。培养阳性率提高可以得到更多的临床菌株，可以对更多的结核病患者进行耐药检测，同时，也能发现更多的NTM患者，从而为临床诊断和治疗提供更准确的指导。

手工液体培养法可以显著缩短报告阳性时间。国内研究发现疑似患者的手工MGIT培养法的平均报告阳性时间为13.63 d，而中和离心固体培养法为28.67 d[10]。王晓艳等[11]报道的自动化液体MGIT培养法涂阳标本的平均报告阳性时间仅为8.75 d，涂阴标本为16.04 d。国外研究的结果与国内相似，发现MGIT培养法的平均报告阳性时间在2至 3周内[8-9]。本研究的手工液体培养法中位报告阳性时间为2周，近95%的阳性结果报告阳性时间在4周内，均显著短于中和离心固体培养法。此外，由于本研究中每周仅对手工液体培养管观察2次，对中和离心固体培养管观察1次，因此，实际报告阳性时间很可能短于本研究报告的报告阳性时间。

本研究中，手工液体培养法的污染率为10.4%，高于国内研究报道的手工MGIT培养法的5.8%和仪器MGIT培养法的6.2%[12]，也高于国外研究报道的手工MGIT培养法的1.4%[13]。但是，早些年以及近些年也有研究报道MGIT培养法的污染率在15%左右[9,14]。本研究中和离心固体培养法的污染率为10.5%，明显高于国内学者报道的4.0%[10]，也高于国外的9.3%[9]。总之，本研究手工液体培养法的污染率略高于正常值，但中和离心固体培养法的污染率是正常值的两倍。目前对导致污染率高的具体原因还不清楚。尽管在实验过程中我们尽量严格按照标准操作流程，但由于我们使用的是商品化的培养基和消化液等耗材，未对其不同批次产品进行质量控制。同时，我们尽管在保质期内使用这些耗材，但存储时间长是否会影响污染率也不清楚，这些都有待今后的工作中予以解决。

目前我国县级结核病实验室大多未开展痰培养，在开展的地区也主要是采用固体培养方法，本研究证明手工液体培养法相比于中和离心固体培养法，不仅显著提高了阳性率，而且明显缩短了报告阳性的时间。手工液体培养法的操作并不复杂，试剂和仪器经济可及。手工液体培养法仅需要1支培养管(中和离心固体培养法需要2支，简单固体培养法需要4支)，其成本与固体培养法相当。此外，手工MFLM培养法能多检出30%菌阳肺结核患者，更利于药物敏感试验的开展，可以发现更多耐药患者，为诊断和治疗提供指导，从而降低结核病的疫情。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献邱勇：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、起草文章；李蒙：分析/解释数据、起草文章、对文章的知识性内容作批评性审阅、统计分析；屈榕：实施研究、采集数据；田发君：实施研究、采集数据