复合益生素对热应激肉鸡肠道功能的影响

■李相安 邹本革 王 政 王文博

（1.青岛农业大学海都学院，山东 烟台 265200；2.青岛根源生物技术集团有限公司，山东 青岛 266000）

白羽肉鸡代谢能力强、产热多，散热能力弱，养殖密度大，过度依赖设备通风散热[1-2]，夏季散热不充分容易导致热应激，是现代白羽肉鸡养殖损失的主要原因之一[3-5]。

发生热应激时，肉鸡血液动员至呼吸、表皮系统参与散热，相应其他组织血量减少，长期导致组织缺血，对于消化系统来说，主要引起肠道内皮细胞之间紧密连接破坏，引起肠道屏障功能减弱[6-7]，进而出现大分子通透性增加，诱发炎症反应[8]，最终导致机体过度消耗出现其他症状甚至死亡，造成养殖损失。

缓解热应激的方法分内外调节两种：外部调剂主要包括畜舍设计、通风、洒水、遮蔽等，通过降低环境温度或提高散热效率来减少环境热影响；内部调节有饲料配方和饲料添加剂两种，饲料配方调节主要是降低粗蛋白含量，减少消化产热；文献报道可见的缓解热应激的饲料添加剂有益生素[9-11]、抗生素、抗氧化剂、维生素、矿物质、益生素、精油等。

其中益生素缓解热应激的机理研究较少，多数学者认为益生素从下调致炎因子表达、改善肠道屏障功能[12]以及缓解宿主氧化应激[13]等几个方面缓解热应激的副作用，从而提高动物生产性能。

采食量、生产性能是养殖现场对热应激损伤的重要评价指标；上皮细胞紧密连接、黏液素mRNA 相对表达水平能侧面反映肠道损伤情况；肠黏膜致炎因子、抑炎因子、Toll样受体和核因子κB（NF-κB）mRNA相对表达水平可以反馈热应激状况对肠道的影响；而血清抗氧化指标水平和热休克蛋白70（HSP70）mRNA相对表达水平可以反映热损伤后修复情况。

热应激条件下益生素对动物生产性能、肠道屏障功能及抗氧化能力的影响的综合数据少见报道。因此本试验选取复合益生菌作为热应激修复剂，以基础日粮为对照组，观察益生素在热应激条件下对白羽肉鸡生产性能、肠道屏障及有益微生物丰度、炎症反应、热应激修复等几个方面的影响，为实际生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用复合益生素制剂1（地衣芽孢杆菌1.31×1010CFU/g、凝结芽孢杆菌1.80×1010CFU/g）、复合益生素制剂2（凝结芽孢杆菌1.80×1010CFU/g、酪酸菌2.45×108CFU/g）和复合益生素制剂3（地衣芽孢杆菌1.31×1010CFU/g、凝结芽孢杆菌1.80×1010CFU/g、酪酸菌2.45×108CFU/g）由青岛某生物公司提供。试验所用白羽肉鸡（ROSS）来自于当地农场（山东青岛）。

1.2 试验设计

试验于2019年11月在青岛根源研发中心动物实验室进行，1日龄白羽肉鸡240羽，分为4个处理组：对照组、益生素1组、益生素2组和益生素3组。

每个处理组3个重复，每个重复20羽，公母各半，自由采食和饮水。1 日龄环境温度（35.0±1.1）℃、相对湿度（65±5）%，之后每周降低2.8 ℃，21 日龄达26.7 ℃、相对湿度（65±5）%。22 日龄开始热应激处理：每天9：00～17：00 热风炉调节至环境温度为35 ℃、相对湿度75%；17:00～次日9：00 自然通风，至42日龄试验结束。

试验结束统计各处理组生产性能，并且每个处理组随机选取6 羽鸡屠宰采样分析。所有试验操作在青岛农业大学动物伦理委员会监督下进行。

1.3 日粮组成及营养水平

试验所用饲料参考NRC（1998）肉用仔鸡的饲养标准，基22～42日龄基础日粮组成和营养水平见表2。

表1 试验分组

表2 试验日粮组成及营养水平（干物质基础）

1.4 饲养管理及生产性能记录

每日8：00、14：00分别记录环境温度和湿度。每周统计耗料，同时进行称重，计算平均日采食量、死淘率、平均体重和料重比。

1.5 样品采集及测定指标

各组随机选取6羽白羽肉鸡颈动脉放血屠宰，取空肠中段，刮取内侧黏膜检测肠黏膜致炎因子、抑炎因子等；另取盲肠肠道内容物用于肠道有益微生物丰度分析；并另取一段空肠样品，用无菌生理盐水冲净后用液氮冷冻并保存于-80 ℃以测定上皮细胞紧密连接、黏液素和HSP70 mRNA相对表达水平。

1.5.1 DNA提取和测序

采用肠道内容物基因组DNA提取试剂盒提取各组肉仔鸡盲肠内容物微生物总DNA，每组高通量测序样本数为6个。按指定测序区域（16S rDNA V3～V4区）合成带有barcode 的特异性引物，构建Illumina PE250文库后上机，由上海凌恩生物科技有限公司进行高通量测序。利用Illumina PE250 平台测序得到的PE reads 根据overlap 关系进行拼接，并对序列质量进行品控和过滤，区分样本后进行操作分类单元（OTU）聚类分析和物种分类学分析。基于分类学信息，在各分类水平上进行群落结构的统计分析。

1.5.2 血清抗氧化指标测定

颈动脉放血，4 ℃留置，析出血清检测超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化酶（CAT）和丙二醛（MDA）含量（上海纪宁实业有限公司，上海）。

1.5.3 mRNA相对表达水平测定

试剂盒提取空肠黏膜或空肠样品总RNA（RNA Extraction Kit，TakaRa），免疫因子引物序列如表3所示。

表3 实时定量PCR使用引物序列

1.6 统计分析

试验数据经Microsoft Excel 软件初步处理后，利用SPSS 16.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 生长性能（见表4）

如表4 所示，各益生素组均重、平均日采食量均高于对照组（P＞0.05）。除益生素2 组外，各益生素组的死淘率、料重比均低于对照组（P＞0.05）。

表4 热应激对各处理组白羽肉鸡生长性能的影响

2.2 肠道屏障（见表5、表6）

表6 热应激对各处理组白羽肉鸡空肠样品黏液素mRNA相对表达水平的影响

由表5 可知，益生素组ZO-1 mRNA 相对于对照组显著降低（P＜0.05），且益生素各组E-cadherin 和Occlaudin mRNA 相对表达水平平均值低于对照组（P＞0.05），表明受热应激影响，对照组紧密连接蛋白E-cadherin、Occlaudin 和ZO-1 mRNA 相对表达水平升高，而3种复合益生素都能有效缓解由于热应激造成的鸡肠道紧密连接蛋白的剧烈变化。

表5 热应激对各处理组白羽肉鸡空肠样品紧密连接蛋白mRNA相对表达水平的影响

由表6 可知，3 个益生素组MUC-2 和MUC-5ac mRNA 相对表达水平显著低于对照组（P＜0.05），表明受热应激影响，对照组MUC-2 和MUC-5ac mRNA 相对表达水平升高，而3种复合益生素都能有效缓解由于热应激造成的鸡肠道上皮细胞黏液素分泌的剧烈变化。

2.3 炎症反应及有益微生物丰度（见表7～表10）

表7 热应激对各处理组白羽肉鸡空肠黏膜致炎因子mRNA相对表达水平的影响

表8 热应激对各处理组白羽肉鸡空肠黏膜抑炎因子mRNA相对表达水平的影响

表9 热应激对各处理组白羽肉鸡空肠黏膜Toll样受体及NF-κB mRNA相对表达水平的影响

表10 热应激对各处理组白羽肉鸡肠道食糜乳酸菌及大肠杆菌-志贺氏菌属丰度的影响（%）

益生素组iNOS mRNA的相对表达水平显著低于对照组（P＜0.05），各组之间致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达水平无显著性差异（P＞0.05），益生素组mRNA 相对表达水平均值低于对照组（表7），表明复合益生素能够降低热应激条件下白羽肉鸡肠道黏膜中致炎因子相对表达水平。

益生素1、2 组各抑炎因子相对表达水平均低于对照组，益生素3 组IL-10 mRNA 相对表达水平与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05），表明复合益生素能降低热应激条件下白羽肉鸡肠道黏膜中致炎因子和抑炎因子mRNA相对表达水平。

益生素组NF-κB 相对表达水平显著低于对照组（P＜0.05）；益生素组TLR-5 mRNA相对表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。3个益生素组乳酸杆菌丰度显著高于对照组（P＜0.05），而大肠杆菌-志贺氏菌属丰度显著低于对照组（P＜0.05）（见表10），表明益生素的添加改善了白羽肉鸡肠道有益微生物丰度。

2.4 热应激修复（见表11、表12）

表11 热应激对各处理组白羽肉鸡空肠样品热应激蛋白mRNA相对表达水平的影响

表12 热应激对各处理组白羽肉鸡血清抗氧化指标的影响

益生素组HSP70 mRNA 相对表达水平平均值高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。益生素2 组HSP90 mRNA 相对表达水平显著高于其他各组（P＜0.05）。益生素组血清抗氧化指标SOD、GSH-Px、TAOC 水平显著高于对照组（P＜0.05），MDA 水平低于对照组。本试验中益生素2 组和益生素3 组MDA 水平显著低于对照组，益生素1组MDA水平与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05），但是平均值低于对照组，表明益生素提高了白羽肉鸡的抗氧化能力。

3 讨论

高温季节肉鸡发生热应激表现为采食量减少[14]、饲料利用率低[15-16]等，是养殖损失的重要原因之一。热应激时血液优先供应皮肤及呼吸系统散热，导致其他器官血液供应不足。热应激诱发肠道损伤的机理一般认为是缺血[17-18]引起肠壁细胞通透性、紧密连接破坏，导致肠道屏障破坏，外源物质进入循环系统诱发炎症[19-20]，进一步影响代谢及动物健康。

生产性能方面，热应激状况下肉鸡机体调动能量降温，表现为食欲下降，料重比升高，这一点从采食量、均重、料重比等方面数据有体现；本试验结果表明益生菌对热应激后的动物生产性能有提高作用，与Parisa 等[21]、Sun 等[22]报道相符合，验证了复合益生素有助于提高热应激状况下白羽肉鸡的均重；本试验益生素组体重增加较大，所以料重比与对照组相比差异不大。

在热应激缺血导致肠道细胞旁通透性增加、屏障破坏[23-26]，本试验结果表明复合益生素降低白羽肉鸡空肠紧密连接蛋白、黏液素mRNA 的相对表达水平，该结果与Zhang等[12]报道存在不一致。Soheil等[20]认为E-cadherin、Claudin-5 和ZO-1 mRNA 表达水平显著升高，是因为Cadherins 蛋白表达水平降低后宿主产生的补偿效应。结合本试验结果分析认为对照组紧密连接蛋白和黏液素mRNA相对表达水平升高，反映出对照组的热应激应答反应较为剧烈，复合益生素则有效维护了肠道屏障功能。另外添加益生素能有效地改善肠道有益微生物丰度，为动物肠道屏障增加一层保护。

本试验热应激条件下益生素组致炎因子mRNA相对表达水平降低，而且抑炎因子mRNA相对表达水平降低，表明复合益生素不仅降低了致炎因子mRNA的相对表达水平，同时维持了肠道致炎因子和抑炎因子之间的平衡[10-11，23]。

试验中3 个益生素组HSP70 mRNA 相对表达水平平均值高于对照组（P＞0.05）、血清抗氧化指标均优于对照组（P＜0.05），表明饲料中添加3 种复合益生素缓解了由热应激造成的动物机体氧化损伤[10-11，23]，且机体修复能力[27-29]优于对照组。

综上所述，复合益生素有效缓解了由热应激导致的屏障功能损伤、肠道炎症反应和氧化应激，有利于提高白羽肉鸡的均重。无论是热应激还是病理应激，首先受到影响的是动物的肠道屏障，继而免疫功能被激活并造成生产性能下降，因此增强动物肠道屏障的防御能力，减少动物感染的概率是后抗生素时代保障动物生产性能的前提条件。本研究结果可为日粮调控改善高温条件下鸡群的肠道健康及保障肉鸡的生长提供参考，具有重要的实际应用意义。