豌豆多肽-亚铁螯合物制备工艺优化及抗氧化研究

尹乐斌，何平，李乐乐，刘桠丽，杨学为，罗雪韵

(1.邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000；2.豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室，湖南 邵阳 422000)

豌豆(PisumsativumL.)是一种组成比较平衡优良的植物蛋白资源[1]，不含植物性雌性激素等优点，豌豆蛋白占干重的23%～25%[2]。目前，已知豌豆蛋白含有3种过敏原[3]，食用后可能造成体内酸碱失衡、腹泻、贫血甚至出现神志不清、休克等不良反应，影响豌豆蛋白的应用领域，人们常采用酶解法[4]改变过敏原的线性或构象表位制备豌豆多肽，开发低过敏原的豌豆蛋白。豌豆多肽富含人体必需氨基酸[5]，具备易消化吸收、稳定性强、促进肠道有益菌生长[6]等优点，可作为恢复期患者和消化功能低下的老年人的辅助营养物质，也可加入到各类调味品的调制中[7]。作为食品原料，豌豆多肽比豌豆蛋白具有更广泛的应用前景。因此，对豌豆多肽进行开发和研究具有一定的价值。

铁是机体必不可少的微量元素。当体内缺铁时，会造成贫血，影响儿童生长、智力和运动的发育[8]。而传统铁补充剂中，一代补铁剂硫酸亚铁因释放铁离子快速引起恶心、呕吐等不良反应[9]，二代可溶性小分子有机酸-铁盐螯合物具有成本高[10]、二价铁离子易不稳定等缺点。因此，寻找新型铁补充剂是目前的研究热点。当前，食源性有机肽-亚铁螯合物可以维持铁以亚铁离子的形式被人体吸收，同时具有成本低、能耗低、无毒副作用等优点，是一种理想的铁补充剂。毕秋芸[11]将裙带菜多肽与亚铁离子螯合制备裙带菜多肽-亚铁螯合物，肖怀秋等[12]将花生肽与亚铁螯合制备花生多肽-亚铁螯合物，均扩大了人体铁补充剂的来源，丰富了补充剂的种类。本研究对豌豆多肽与亚铁离子螯合制备螯合物工艺进行优化，并测得最佳工艺条件下豌豆多肽-亚铁螯合物的抗氧化活性，为豌豆蛋白质资源的充分利用以及拓宽铁补充剂的来源提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆蛋白：实验室提取所得；碱性蛋白酶(200000 U/g)：四川合氏生物科技有限公司；抗坏血酸(分析纯)：西陇科学股份有限公司；氯化亚铁(分析纯)：天津市大茂化学试剂厂；1,10-菲啰啉(一水合物，分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；ABTS(2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，纯度>98.0%)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，纯度>97.0%)：上海如吉生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

双列四孔恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；3H16RI台式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；D-7紫外可见分光光度计 南京菲勒仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亚铁离子浓度标准曲线的制作

参考魏冬梅等[13]的方法并进行适当调整。取0.4 mL样品，加入pH为4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 mL、1%盐酸羟胺0.5 mL、0.1%邻菲啰啉1 mL，定容至10 mL。采用紫外分光光度计在440～600 nm处进行扫描，确定最佳测定波长以及最佳反应时间。

标准曲线的绘制：用莫尔盐(硫酸亚铁铵Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O)配制不同浓度的亚铁离子溶液，分别加入缓冲液显色剂，反应一段时间后，于最佳测定波长处测定吸光度，最后绘制相关性标准曲线(亚铁离子浓度与吸光度)。

1.3.2 豌豆多肽的制备

运用碱沉淀法[14]提取得到豌豆蛋白，称取豌豆蛋白7.2 g，配制7.2%豌豆乳，调节pH为12，加入0.42 g碱性蛋白酶，50.5 ℃酶解2.8 h，得到豌豆蛋白酶解液，超滤得到豌豆多肽(分子量<800 Da)。

1.3.3 豌豆多肽-亚铁螯合物的制备

称取1.500，1.875，2.250，2.625，3.000 g豌豆多肽并加入50 mL水于锥形瓶中，调节溶液pH为6.5，添加抗坏血酸0.075，0.150，0.225，0.300，0.375 g、氯化亚铁1.5 g，在温度20，25，30，35，40 ℃恒温螯合40，50，60，70，80 min，得到螯合后的样品。

根据单因素优化试验结果，将A螯合时间、B抗坏血酸添加量、C螯合温度、D多肽添加量作为自变量，设置低(-1)、中(0)、高(1)3个水平，以豌豆多肽与亚铁螯合率为响应值，进行响应面试验。通过Design-Expert软件预测制备豌豆多肽-亚铁螯合物的最佳工艺，最后进行验证试验。响应面因素与水平表见表1。

表1 响应面分析法的因素与水平表

1.3.4 样品螯合率的测定

将螯合后的样品离心(10000 r/min，10 min)，弃去上清液，加入10 mL无水乙醇洗涤，离心(10000 r/min，10 min)，得沉淀豌豆多肽-亚铁螯合物，加入10 mL 2 mol/L盐酸溶液水解，离心(10000 r/min，10 min)，得到含有亚铁离子的上清液，采用邻菲啰啉比色法测定亚铁离子含量，通过下式计算得到多肽与亚铁离子的螯合率。

式中：m1为螯合物中亚铁离子含量，g；m2为加入螯合体系的亚铁离子含量，g。

1.3.5 抗氧化活性

通过测定ABTS[15]、DPPH[16]自由基清除率来评价豌豆多肽-亚铁螯合物的抗氧化活性。

1.4 试验数据处理

试验每组重复3次，用WPS Office、SPSS、Design-Expert V8.0.6.1等软件进行误差分析、绘图、方差分析、响应面优化等数据分析。

2 结果与分析

2.1 邻菲啰啉法亚铁离子标准曲线

采用邻菲罗啉法测定亚铁离子浓度，在波长440～600 nm处的扫描图见图1，发现测定波长为510 nm时，与空白样相比，样品的吸光度最大；反应时间对吸光度的影响见图2，当样品与显色剂反应达到20 min后，增大反应时间，样品的吸光度变化不大，因此，选取测定波长510 nm、反应时间20 min进行后续试验。

图1 样品的光谱扫描Fig.1 The spectral scanning of the sample

图2 不同反应时间下样品吸光度Fig.2 The absorbance of sample at different reaction time

经过试验得到亚铁离子浓度的标准曲线，见图3。

图3 亚铁离子浓度标准曲线Fig.3 The standard curve of ferrous ion concentration

由图3可知，溶液浓度与吸光度呈正相关，得到方程式：A=8.221x-0.0013，其中相关系数R2=0.9999，较好，可用来模拟铁离子浓度与吸光度的关系。

2.2 豌豆多肽与氯化亚铁制备豌豆多肽-亚铁单因素试验

螯合时间对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响见图4。

由图4可知，随着螯合时间延长，豌豆多肽与亚铁离子的螯合率增大，可能是螯合时间过短，反应不充分。超过最佳螯合时间70 min后，由于体系pH值变化或螯合物稳定性降低而导致螯合物的结构不稳定，亚铁离子被释放到多肽结构外部成为游离状态，从而降低其螯合率[17]。因此,选择螯合时间70 min进行后续试验。

图4 螯合时间对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响Fig.4 The effect of chelation time on pea polypeptide-ferrous chelation rate

抗坏血酸添加量对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响见图5。

图5 抗坏血酸添加量对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响Fig.5 The effect of ascorbic acid additive amount on pea polypeptide-ferrous chelation rate

抗坏血酸主要用来发挥抗氧化性，使亚铁离子(Fe2+)避免被氧化为三价铁离子(Fe3+)[18]。由图5可知，当抗坏血酸浓度较低(低于0.225 g)时，无法保证铁以亚铁的形式存在，所以螯合率低。当体系中抗坏血酸含量过量时，反应体系的酸碱值遭到破坏，造成螯合率略有下降[19]。最佳抗坏血酸添加量为0.225 g。

螯合温度对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响见图6。

图6 螯合温度对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响Fig.6 The effect of chelation temperature on peapolypeptide-ferrous chelation rate

由图6可知，随着温度的上升，多肽分子结构进一步舒展，同时分子和离子间的热运动加剧，促进整个螯合反应的进行[20]。而当温度进一步升高超过30 ℃时，抗坏血酸被破坏，无法维持亚铁离子价态的稳定，导致Fe2+被氧化为Fe3+，螯合率下降。豌豆多肽与亚铁离子螯合是放热反应，温度过高会抑制反应的进行，还会促进亚铁离子氧化水解生成Fe(OH)3沉淀，螯合率下降[21]。因此,选择螯合温度30 ℃进行后续试验。

豌豆多肽添加量对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响见图7。

图7 豌豆多肽添加量对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响 Fig.7 The effect of pea polypeptide additive amount polypeptide-ferrous chelationrate on pea

豌豆多肽结合亚铁离子的数量是一定的，当反应体系中多肽含量较低时，螯合物的环状结构极其不稳定，影响螯合率[22]。由图7可知，当豌豆多肽含量超过2.625 g时，氯化亚铁结合的位点有限，会造成多肽的浪费[23]。所以,螯合最佳豌豆多肽添加量为2.625 g。

2.3 豌豆多肽与氯化亚铁制备豌豆多肽-亚铁响应面优化试验

在单因素试验的基础上进行响应面分析，响应面方案及试验结果见表2。

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Response surface analysis scheme and experimental results

续 表

4个单因素经过回归拟合后，得到豌豆多肽、Fe2+制备豌豆多肽-Fe2+螯合物工艺条件的二次项回归方程：

螯合率(%)=+31.17+1.19A+1.26B-1.52C+1.26D+1.63AB-1.26AC-1.61AD+1.83BC-2.02BD+1.42CD-4.30A2-2.05B2-2.06C2-1.37D2。

根据响应面试验结果，得出螯合率方差分析表，见表3。

表3 螯合率方差分析表Table 3 Analysis of variance of chelation rate

由表3可知，试验模型的P<0.0001，表明模型与回归方程显著；螯合率的失拟项P=0.8421，不显著(P>0.05)，相关系数R2=0.9125，校正系数RAdj2=0.825，说明回归方程与实际拟合度较好，响应面的预测值与本次试验测得的具体值联系紧密，试验误差小，本模型适用于预测不同螯合条件下豌豆多肽-亚铁螯合率；由F值可知，各因素对豌豆多肽-亚铁螯合率的影响顺序为C螯合温度>B抗坏血酸添加量>D多肽添加量>A螯合时间。

经软件分析结合实际生产情况进行验证试验，该模型得到的豌豆多肽-亚铁螯合物最佳条件为螯合时间72.72 min、抗坏血酸添加量0.25 g、螯合温度28.2 ℃、多肽添加量2.58 g，螯合率为31.394%，与预测值差异不显著(P>0.05)。

2.4 抗氧化活性

由图8可知，在0～0.16 mg/mL范围内，随着豌豆多肽-亚铁螯合物质量浓度的增加，ABTS自由基的清除率增加，0.16 mg/mL时清除率约为100%。

图8 不同样品对ABTS自由基清除率Fig.8 The scavenging rate of ABTS free radicals by different samples

由图9可知，豌豆多肽-亚铁螯合物质量浓度在0～0.64 mg/mL范围内对DPPH自由基的清除率不断增加，之后趋于稳定。综上所述，豌豆多肽-亚铁螯合物对ABTS自由基、DPPH自由基具有较好的清除效果。几种不同样品的抗氧化活性能力为：Vc(维生素C)>亚铁离子>豌豆多肽-亚铁螯合物>豌豆多肽，说明螯合物将两个原料较好地结合在一起共同发挥清除活性，与马利华[24]的实验结果相似。经过计算得到豌豆多肽-亚铁螯合物对ABTS自由基、DPPH自由基的EC50(半数清除率)分别为0.084，0.268 mg/mL。

图9 不同样品对DPPH自由基清除率Fig.9 The scavenging rate of DPPH free radicals by different samples

3 结论

通过将豌豆多肽与亚铁离子进行螯合工艺优化得到最佳螯合条件：螯合时间72.72 min、抗坏血酸添加量0.25 g、螯合温度28.2 ℃、多肽添加量2.58 g，此时制备豌豆多肽-亚铁螯合率为31.394%。对亚铁离子、豌豆多肽、豌豆多肽-亚铁螯合物、Vc进行ABTS、DPPH自由基清除率比较，发现螯合物的抗氧化活性较原豌豆多肽有所提高，且具有较好的抗氧化活性。与李文军等[25]的实验结果类似，证明大豆多肽铁螯合物具备抗氧化性，有较高的生物活性，是优质的铁补充剂。将铁与多肽螯合研究新型贮铁方法，有利于挖掘其在食品调味品、添加剂、保健食品等方面的潜力，扩大其应用前景。但目前对螯合物的螯合机制以及体外模拟口腔、胃、肠仍处于初级阶段，因此后续可对螯合物的结构进行表征探究螯合机理，对样品进行动物模拟消化研究。