氨基甲酸乙酯降解菌株的筛选鉴定与发酵产酶优化

杨攀平，丁炎，仲梦园，李锐，吕璨，徐江南， 孙恬晋，卢河东,2*

(1.淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223001；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，又名脲烷(urethane)，是一种广泛存在于各种发酵食品、饮料、烟草和被污染的环境空气中的致癌物[1-2]，因其对人体有潜在的致毒性和致癌性，2007年被世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC)列为2A类致癌物[3]。研究表明氨基甲酸乙酯普遍存在于调味品(酱油、食醋)和发酵饮品(白酒、黄酒)中，人体不可避免地暴露其中[4]，因此探索有效可行的降解氨基甲酸乙酯的方法对保障食品安全具有重要意义。

随着人们生活水平和生活质量的提高，食品安全问题成为社会热点[5]。目前有效减除食品中残留的氨基甲酸乙酯常用方法有减少氨基甲酸乙酯生物合成的前体物质[6]；通过高通量筛选技术和基因工程技术分离或者改造具有脲酶活性和氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株以及优化发酵工艺[7]等。基于成本和生物安全性等因素限制，不断挖掘优质食源性氨基甲酸乙酯降解菌株成为经济、有效的防控途径。

本实验从甜酒酒曲中筛选到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的菌株，通过形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA基因序列分析进行种属鉴定，采用单因素实验及正交实验分析得到最优的培养基组合和发酵条件，以期为后续的生产应用提供研究基础。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

湖北宜昌甜酒酒曲。

1.1.2 主要实验试剂与仪器

大豆蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖(均为分析纯试剂)：国药集团化学试剂有限公司；硫酸铜、硫酸铵、氯化铵、氨基甲酸乙酯、溴甲酚紫、苯酚、次氯酸钠、亚硝基铁氰化钠：阿拉丁公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒(E.Z.N.A.DNA Bacterial DNA Kit)：北京诺博莱德科技有限公司。

Eppendorf冷冻离心机、Eppendorf PCR仪、Eppendorf 移液枪 德国Eppendorf股份有限公司；722紫外分光光度计、电泳仪。

显色剂 Ⅰ：准确称取苯酚60 g、亚硝基铁氰化钠2.5 g定容于1 L水中后于冰箱中冷藏；显色剂Ⅱ：准确称取52.5 g NaOH、30 mL次氯酸钠定容于1 L容量瓶后于冰箱中冷藏；终止剂：10%的三氯乙酸。

1.1.3 培养基

固体营养肉汤培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，2%(W/V)琼脂。

LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，固体培养基加入2%(W/V)琼脂。

筛选培养基：酵母粉24 g/L，蛋白胨12 g/L，甘油5 g/L，KH2PO42.32 g/L，溴甲酚紫1.0 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，pH 7.0。

种子培养基：牛肉浸膏 5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 产氨基甲酸乙酯水解酶菌株的筛选

1.2.1.1 高温培养法

将甜酒酒曲粉碎混匀，准确称取5 g置于50 mL无菌水中，在180 r/min的摇床中振荡20 min，将菌悬液进行适当的浓度梯度稀释，取100 L稀释液涂布于肉汤培养基上，在50 ℃培养箱中培养24 h。

1.2.1.2 高盐处理法

将甜酒酒曲粉碎后，准确称取5 g置于50 mL无菌水中，于37 ℃，180 r/min摇床中振荡20 min。菌悬液经过适当的稀释后取100 μL涂布于高盐培养基上，在37 ℃培养箱中培养24 h。

初筛：待平板长出菌落后，用记号笔标记并将菌落转移至装有筛选培养基的96深孔板中，于恒温振荡器(37 ℃，200 r/min)中培养24 h，选取培养基变为紫色的菌体作为初筛得到的目的菌株。

复筛：将初筛获得的菌株接种至装有种子培养基的摇瓶中，在37 ℃的摇床中培养24 h，转速为180 r/min。将菌液置于离心管中，于冷冻离心机(4 ℃)中5500 r/min离心10 min，并用 20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤菌体，制备混悬液，在0 ℃下进行超声破碎，待菌液变澄清为止，并检测酶活。

1.2.2 产氨基甲酸乙酯水解酶的菌株鉴定

1.2.2.1 菌株的形态学与生理生化鉴定

将复筛所选菌株经染色、光学显微镜观察菌体个体及群体形态，生理生化反应参照《微生物学实验指导》[8-9]。

1.2.2.2 16S rDNA 基因序列分析

参照Omega革兰氏阳性菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行提取，提取筛选菌株的基因组，用细菌16S rDNA通用引物进行16S rDNA序列扩增并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果提交到NCBI数据库进行Blast序列比对分析，利用MEGA 9.1构建系统发育树。

1.2.3 氨基甲酸乙酯酶活测定方法

1.2.3.1 氨基甲酸乙酯酶活定义

在常压37 ℃，pH 7的条件下，每1 min分解1 nmol氨或1 nmol乙醇的酶量为1个酶活单位(U)[10]。

1.2.3.2 酶活测定方法——Berthelot reaction

用比色法测定氨基甲酸乙酯水解酶的酶活，取酶液1 mL，加入1 mL 3%氨基甲酸乙酯溶液，37 ℃反应30 min，加入1 mL终止液，37 ℃反应30 min，加入1 mL终止液，混匀后加入1 mL显色剂Ⅰ和1 mL显色剂Ⅱ，强烈振荡，37 ℃保温20 min后取出，用超纯水稀释到10 mL，在625 nm处比色，并记录OD值[11]。

1.2.4 标准曲线绘制

用氯化铵配制不同浓度的标准溶液，在625 nm下测定吸光值，绘制标准曲线，见图1。

图1 NH4Cl 标准曲线Fig.1 The standard curve of NH4Cl

1.2.5 发酵培养基的优化

按3%的接种量对氮源、碳源、金属离子(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Mg2+)等培养基条件进行设计，24 h后取样测定氨基甲酸乙酯水解酶活性。

1.2.6 培养条件优化

选用温度、pH、接种量和装液量等发酵条件，24 h后取样测定氨基甲酸乙酯水解酶活性，研究其对解淀粉芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶活性的影响。

1.2.7 正交实验(设计正交表)

选取单因素实验中对解淀粉芽孢杆菌酶活性影响显著的3个因素(氮源浓度、碳源浓度、金属离子)进行三因素三水平正交实验(见表1)，以菌株分解EC的活性为考察指标，探究该菌株的最佳产酶条件。

1.2.8 数据分析

采用Origin 2019b 作图，采用SPSS 23.0进行数据分析和正交实验数据统计，实验均为3组平行。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

经过不同的初筛条件从甜酒酒曲中分离活的23株菌，通过筛选培养基过夜培养，筛选出能够产生氨基甲酸乙酯水解酶的两株菌LPB-13和LPB-19。将其接种于发酵培养基中培养24 h后利用Berthelot reaction 比色法测定酶活性，LPB-13的酶活为360 U/L，LPB-19的酶活为820 U/L。结果表明，两株菌的氨基甲酸乙酯水解酶活性差异显著，其中LPB-19的酶活性更强，因此将其作为后续的发酵条件优化对象。

2.2 氨基甲酸乙酯水解酶产生菌株形态学与生理生化鉴定

菌株 LPB-19呈短杆状，染色均匀，革兰氏染色阳性，可形成内生孢子，在液体培养基中静置培养,培养基表面形成菌膜。在LB培养基上呈白色不透明菌落，菌落边缘不规则，湿润有黏性。接触酶实验阳性，氧化酶实验阴性。该菌株需氧生长；甲基红阴性；石蕊牛奶实验中，细菌产蛋白酶使牛奶胨化；产凝乳酶使牛奶凝固，能水解淀粉，耐受10%的NaCl。糖发酵实验中，不能利用鼠李糖、D-木糖、α-乳糖，结果见表2。通过上述形态及生理生化特征，初步将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。鉴于枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为近源种，且生理特征接近，为了更进一步分离枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，本实验进行了16S rDNA序列分析。

表2 菌株 LPB-19生理生化特性Table 2 The physiological and biochemical properties of strain LPB-19

续 表

2.3 氨基甲酸乙酯水解酶产生株16S rDNA基因序列分析

以菌株LPB-19基因组DNA为模板，利用16S rDNA通用引物扩增，PCR扩增产物经纯化后进行测序，对该序列进行Blast分析，结果显示菌株LPB-19与B.amyloliquefaciensDSW 7相似性达到99.4%，利用 MEGA 4.1构建菌种系统发育树，结果见图2。结合前期形态学及生理生化分析结果，菌株LPB-19被鉴定为B.amyloliquefaciens。

图2 B. amyloliquefaciens LPB-19 16S rDNA基因系统发育树分析Fig.2 The phylogenetic tree analysis of B. amyloliquefaciens LPB-19 16S rDNA gene

2.4 培养基成分对菌株生长的影响

2.4.1 碳源及其浓度对菌株产酶的影响

碳源对菌珠LPB-19酶活性的影响见图3。解淀粉芽孢杆菌LPB-19均能利用果糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖，以麦芽糖为碳源时菌体生长最为旺盛，其氨基甲酸乙酯水解酶活性最高；其次为蔗糖，其中以果糖为碳源的菌株的生物量最小，菌株的酶活最低；相比之下，菌株在葡萄糖为碳源的培养基中主要以营养生长为主，其菌体干重仅次于麦芽糖，但菌株的产酶活性较低(见图3中a)。由于麦芽糖生产成本高，市场价格较为昂贵，考虑到工业化生产成本，选择蔗糖为碳源。考察不同浓度的蔗糖对产酶量的影响，最佳浓度为20 g/L，产酶活力为2367.5 U/L(见图3中b)。

2.4.2 氮源及其浓度对菌株产酶的影响

氮源对菌珠酶活性的影响见图4。以蛋白胨为氮源时菌株的产酶活性最高，而菌株在无机氮源培养基中的生长量低，与有机氮的差异显著，故以蛋白胨为氮源。同时，可以看出蛋白胨的最佳浓度为10 g/L，产酶活性提高至2117 U/L。

2.4.3 金属离子对菌株产酶的影响

选用4种常见金属离子Cu2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+，探究了不同质量浓度的金属离子对解淀粉芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯水解酶的影响，结果见表3。

表3 4种金属离子不同浓度对酶活的影响Table 3 Effects of different concentration of four metal ions on urethanase activity

由表3可知，不同质量浓度和种类的金属离子对菌株的产酶有不同的影响，其中添加Cu2+、Mn2+、Fe3+时不利于产酶，而添加Mg2+至0.05 g/L时，菌株的酶活性为1604.4 U/L，相比于优化前提高了2倍，选择Mg2+的最适浓度为0.05 g/L。

2.5 菌株的培养条件优化

由图5可知，解淀粉芽孢杆菌LPB-19在31～37 ℃生长状况差异不显著，但在33 ℃时酶活最高(见图5中a)。在33 ℃条件下，LPB-19在pH值5～8范围内均能生长，而在pH 6时酶活最高(见图5中b)；在33 ℃，pH 6的条件下，150 r/min下的菌体干重显著低于180，210，240 r/min，而180 r/min下LPB-19的酶活性显著高于其他转速(见图5中c)；在上述优化条件下，接种量为3%时菌株具有较高的酶活(见图5中d)。综上所述，解淀粉芽孢杆菌LPB-19在33 ℃、pH 6、转速180 r/min、接种量3%时具有较高的酶活性。

2.6 正交实验

在最优发酵条件的基础上，对单因素优化实验结果再设计L9(33)正交实验，对蔗糖浓度、蛋白胨浓度和硫酸镁浓度3个因素之间的相互作用进行进一步的探索，结果见表4。根据实验的Kn和R值，得出最佳发酵方案是A3B2C2，即蔗糖25 g/L，蛋白胨12.5 g/L，硫酸镁0.075 g/L，此时的酶活性为4477.02 U/L，是优化前的5.45倍。

表 4 产酶条件优化正交实验结果与分析Table 4 Orthogonal test results and analysis of enzyme production conditions optimization

3 讨论

氨基甲酸乙酯是一种广泛存在于各种调味品、发酵饮品、烟草以及被污染的环境空气中的2A类致癌物[12]，是一种对位点致癌物，能诱发肺癌和淋巴癌等疾病，其毒理作用也随着作用时间和剂量的增加而增强[13]。氰化物和尿素是氨基甲酸乙酯的重要前体物质，在食品发酵过程中可与乙醇作用产生EC，因此减少其在发酵过程中的积累对降低EC至关重要[14]。本实验从甜酒酒曲中分离筛选获得一株内源性氨基甲酸乙酯水解活性的菌株，经生物学鉴定确定为B.amyloliquefaciensLPB-19。

解淀粉芽孢杆菌广泛存在于食物、土壤、植物、动物以及一些极端的环境中，美国食品和药物管理局(FDA)已将其列为安全无毒的微生物，且基于其优越的生物学功能，已被广泛应用于食品、医药、农业以及环境等各个领域中[15-16]，本实验从甜酒酒曲中筛选的菌株LPB-19能适应多种环境，氨基甲酸乙酯降解性能稳定且属于食品安全菌株，相比于酵母菌Y13[17]，其去除氨基甲酸乙酯更具有优势。丁霞等[18]从白酒酒醅中筛选出一株同时能降解氨基甲酸乙酯及其前体尿素的解淀粉芽孢杆菌。孟庆达[19]从白酒酒曲中筛选出高脲酶活性的腐生葡萄球菌，其尿素和氨基甲酸乙酯去除率分别为78.8%、50.3%。李京京等[20]从小鼠肠道筛选出具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌SC02，通过发酵条件优化，最终氨基甲酸乙酯降解酶活高达7066 U/L，与原始培养基的酶活相比提高了350%，说明菌株的氨基甲酸乙酯水解活性受到培养基成分、发酵条件以及复杂的代谢调控影响[21]，在本实验中也得到了相同的实验结果，通过发酵条件和培养基组分优化，最终氨基甲酸乙酯降解酶酶活达到4477 U/L，相比于原始培养基提高了432%。该菌产生最大的氨基甲酸乙酯水解活性在6.0左右，说明降解氨基甲酸乙酯的物质具有较好的耐酸性，这与已报道的氨基甲酸乙酯降解菌株胶红酵母、赖氨酸芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌的最适pH 7.0不同[22]，而发酵体系常以酸性环境为主，由此看来，本实验获得的解淀粉芽孢杆菌LPB-19在去除氨基甲酸乙酯方面更具有优势，因此其在食品发酵中更具有应用价值。

本研究对B.amyloliquefaciensLPB-19菌株的培养基组分、发酵条件进行优化，并进行该菌株的氨基甲酸乙酯降解活性评估，结果表明LPB-19具有较高的氨基甲酸乙酯降解活性，具有降解酿造类调味品、发酵饮品中氨基甲酸乙酯的潜力。在后续的研究中，我们将进行氨基甲酸乙酯降解酶的分离、鉴定和纯化以及通过基因工程方法进行菌株改造，构建生物相容性高、降解活性强的工程菌株，以期可将具有EC降解活性的解淀粉芽孢杆菌作为发酵剂直接加入调味品或者发酵饮品的酿造体系中，降解氨基甲酸乙酯，保障食品安全。