红树莓冻干粉中酚类化合物含量测定及其抗氧化活性研究

王娜，韩海霞，钟志明，王娟

(新疆农业大学 食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

红树莓(RubusidaeusL.)又名覆盆子，蔷薇科悬钩子属类植物[1]，含有多种有益的化合物，包括必需矿物质、维生素、脂肪酸和膳食纤维，以及广泛的酚类化合物[2]，红树莓中酚类物质有花青素、鞣花单宁、黄酮醇(槲皮素)、黄烷醇(儿茶素)、原花青素(原花青素B2)、羟基肉桂酸(没食子酸)等，具有抗氧化、抗炎、抗菌的生物活性[3-4]。

酚类化合物对因产生过氧化作用而导致生物体在结构和功能上损伤的DPPH自由基、羟基自由基和ABTS+自由基等有显著的清除作用，还能与金属形成螯合物，是天然的抗氧化剂[5]。前人研究发现，酚类化合物作为天然抗氧化剂对提高肉类和肉制品货架寿命和脂质稳定性有积极的作用，同时还具有增强食品风味、去除臭味等功能，在食品工业中应用具有广阔的前景。酚类化合物还能通过信号转导途径调控肿瘤抑制基因或致癌基因的表达等，具有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗抑郁、抑菌、调节血脂和提高免疫力等生物学特性[6]。

尽管酚类化合物应用广泛，但其在水果和蔬菜中含量都较低。目前对红树莓中酚类化合物的含量和抗氧化能力的高低，以及对人类健康和营养的好处还未见报道。本研究采用紫外分光光度法(ultraviolet absorption spectrophotometry，UV)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定红树莓冻干粉中酚类化合物含量，并研究其抗氧化的药用价值，为红树莓冻干粉在食品领域的进一步开发利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓冻干粉的制备：将购于新疆伊犁的新鲜红树莓打浆后在-55 ℃冷冻干燥24 h，过80目筛，其质量为红树莓鲜重的12.35%，呈淡红色的状态疏松，封装备用。

标准品没食子酸、儿茶素、原花青素B2、芦丁、鞣花酸、槲皮素：均购于成都麦德生科技有限公司；福林酚：购于上海麦克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)：均购于上海如吉生物科技有限公司；抗坏血酸(分析纯)：购于天津市北辰方正试剂厂；超纯水(自制)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪、DAD 检测器；XPE105电子分析天平(0.01 mg) 梅特勒-托利多(上海)有限公司；80-1电动离心机 金坛市恒丰仪器厂；T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；KQ-250DE超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；YKW-303恒温摇床 长沙永乐康仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液前处理

准确称取1 g红树莓冷冻干燥粉于50 mL烧杯中，加入75%乙醇30 mL，封口，超声提取20 min，离心15 min，即为样品溶液。

1.3.2 总多酚含量的测定

采用福林-酚比色法测定总多酚含量[7]。

1.3.3 总黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量[8]。

1.3.4 花青素含量的测定

采用pH示差法测定花青素含量[9]。

1.3.5 标准品溶液的制备

精密称取没食子酸、儿茶素、原花青素B2、芦丁、鞣花酸、槲皮素对照品适量，用二甲基亚砜溶解，制成浓度分别为没食子酸6 μg/mL、儿茶素15 μg/mL、原花青素B220 μg/mL、芦丁10 μg/mL、鞣花酸20 μg/mL、槲皮素0.5 μg/mL的混合对照品溶液。

1.3.6 HPLC测定方法

没食子酸、儿茶素、原花青素B2、芦丁、鞣花酸、槲皮素的测定方法：Target TC-18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流动相采用甲醇(A)-0.1% 甲酸(B)梯度洗脱，0～2 min，5% A→10% A；2～5 min，10% A→18% A；5～15 min，18% A →30% A；15～32 min，30% A→55% A；32～42 min，55% A→80% A；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温25 ℃；检测波长分别为没食子酸273 nm、儿茶素270 nm、原花青素B2280 nm、芦丁390 nm、鞣花酸254 nm、槲皮素254 nm。

1.3.7 体外抗氧化活性

1.3.7.1 羟自由基清除能力的测定

参照蔡惠钿等[10]的方法稍作修改。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照张玲玲等[11]的方法稍作修改。

1.3.7.3 ABTS+自由基清除能力的测定

参照米雪等[12]的方法稍作修改。

1.3.7.4 还原能力的测定

参照米雪等的方法稍作修改。

2 结果与分析

2.1 UV法测定总多酚、总黄酮和花青素含量

根据实验检测结果，以纵坐标为吸光度，横坐标为没食子酸和芦丁标准品溶液浓度，绘制标准曲线。福林-酚比色法测得总多酚含量的标准曲线回归方程为：Y=0.0128X+0.0858，R2=0.9995，总多酚的含量为72.2 mg/g，高于Anttonen M J等测得的35.9 mg/g[13]；亚硝酸钠-硝酸铝比色法测得总黄酮含量的标准曲线回归方程为：Y=0.0106X+0.026，R2=0.9995，总黄酮含量为10.84 mg/g，高于Saifullah M等测得的4.1 mg/g[14]；pH示差法测得花青素含量为0.18 mg/g，低于Si Xu等测得的0.54 mg/g[15]。

2.2 HPLC法测定酚类物质含量

2.2.1 线性关系、精密度、重复性和稳定性试验

由表1可知，仪器精密度、重复性好，稳定性和线性关系均良好，符合分析要求。

表1 线性关系、精密度、重复性和稳定性试验考察结果(n=6)Table 1 The linear relation, precision, repeatability and stability test results(n=6)

2.2.2 加样回收率试验

取已知含量的红树莓冻干粉末9份，每份约1.0 g，精密称定。精密加入已知浓度的混合对照品溶液；按1.3.1项下方法制成低、中、高3个质量浓度的样品溶液，在1.3.3项色谱条件下进行色谱分析，计算RSD，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果Table 2 The recovery rate test results of samples

由表2可知，6种多酚类成分的加样回收率范围在97.1%～99.3%，RSD均小于5%，其回收率和RSD符合分析的要求。

2.2.3 HPLC测定结果

取对照品和供试品溶液经0.45 μm滤膜超滤后进样测定，色谱图见图1。定量方法采用外标法，结果见表3。

A

由表3可知，测得红树莓中的没食子酸含量高于孟实等测得的0.14 μg/g[16]，但低于Mayara Schulza等测得的0.74 mg/g[17]；儿茶素低于孟实等测得的4.81 μg/g,但高于Mayara Schulza等测得的0.73 μg/g；原花青素B2低于孟实测得的1.92 μg/g；鞣花酸0.64 μg/g高于孟实测得的0.51 μg/g；槲皮素的含量低于Mayara Schulza等测得的1.5 μg/g；红树莓中芦丁含量测定目前还未见报道，酚类物质含量的差异可能是由于品种、环境和地理差异造成的。

表3 红树莓冻干粉的HPLC含量测定结果Table 3 The content determination results of Rubus idaeus L. lyophilized powder by HPLC

2.3 红树莓冻干粉体外抗氧化活性结果

2.3.1 羟基自由基清除能力

羟基自由基具有很高的反应活性，被认为是对生物体有害的氧化剂。羟基自由基会严重破坏邻近的生物分子，从而导致DNA、脂质和蛋白质的氧化破坏。因此，除去羟基自由基对于保护生命系统至关重要[18]。

由图2可知红树莓冻干粉和对照VC对羟基自由基的清除能力。红树莓冻干粉的浓度从0.0625 mg/mL增加到1 mg/mL，与羟自由基清除能力表现出明显的剂量-效应关系。在0.0625～0.25 mg/mL的浓度范围内，红树莓冻干粉的羟基自由基清除能力高于VC，但随着浓度的增大，红树莓的羟基自由基清除能力低于VC，当红树莓冻干粉的浓度达到1 mg/mL时，清除率达到73.56%。由此可知，在一定的浓度范围内，红树莓冻干粉的羟基自由基清除能力高于对照组VC。

图2 红树莓冻干粉对羟基自由基的清除能力Fig.2 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on hydroxyl radical

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力是基于抗氧化剂的氢供体能力。它通过测量简单性，快速性和敏感性广泛用于测试各种抗氧化剂样品的抗氧化能力[19]。

由图3可知红树莓冻干粉和对照Vc对DPPH自由基的清除能力。结果表明，红树莓冻干粉对DPPH自由基的清除能力具有浓度依赖性，当红树莓冻干粉浓度从0.0625～1 mg/mL增加时，剂量-效应关系明显，当红树莓浓度为1 mg/mL时，清除率达到73.84%，对照组Vc随着浓度的升高其DPPH自由基的清除能力变化不显著，而红树莓冻干粉对DPPH自由基的清除能力始终低于Vc。

图3 红树莓冻干粉对DPPH 自由基的清除能力Fig.3 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on DPPH radical

2.3.3 ABTS+·清除能力

ABTS法用于测定生物样品的抗氧化能力。ABTS+·经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·，向其中加入被测物质,如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS+·发生反应而使反应体系褪色[20]。与其他几种抗氧化能力的体外测定法相比，ABTS法快速、简便，与抗氧化剂的生物活性相关性强，因而被广泛地应用于物质的抗氧化能力测定。

由图4可知红树莓冻干粉和对照Vc对ABTS+·的清除能力。红树莓的ABTS+·具有浓度依赖性。当红树莓冻干粉浓度为1 mg/mL 时，对ABTS+·的清除率达到66.15%，但ABTS+·的清除率始终低于Vc。

图4 红树莓冻干粉对ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on ABTS+·

2.3.4 还原能力的测定

抗氧化剂与还原能力之间有直接的相关性，还原剂可以与某些过氧化物的前体反应，防止了过氧化物的形成[21]。因此，化合物或提取物的还原能力是目前应用最为广泛的抗氧化活性的指标之一。

由图5可知红树莓冻干粉和对照Vc的还原能力，还原能力与红树莓冻干粉的浓度呈正相关。红树莓冻干粉浓度和VC浓度从0.0625～1 mg/mL，还原能力随着浓度的增大而不断增加，但是与VC的还原能力相比，红树莓冻干粉的还原能力始终低于VC。但红树莓冻干粉的浓度升高到一定程度之后是否会高于VC有待我们进一步试验的验证。

图5 红树莓冻干粉的还原能力Fig.5 The reducing power of Rubus idaeus L. lyophilized powder

2.4 红树莓冻干粉中酚类化合物与抗氧化活性的相关性分析

根据前面的实验结果，我们将红树莓冻干粉中的酚类物质与抗氧化能力进行相关性分析，结果见图6。

图6 红树莓冻干粉中酚类化合物与抗氧化活性的相关性分析Fig.6 Correlation analysis of phenolic compounds and antioxidant activity of Rubus idaeus L. lyophilized powder

由图6可知，原花青素B2与还原力和DPPH·呈负相关，相关系数分别为0.93和0.96。没食子酸与羟基自由基呈正相关，相关系数为1；对ABTS+·与还原力呈负相关，分别为0.89和0.85。儿茶素与羟基自由基呈正相关，相关系数为0.94；与ABTS+·呈负相关，相关系数为1。芦丁对羟基自由基呈正相关，相关系数为1；对ABTS+·呈负相关，相关系数为0.94。鞣花酸对羟基自由基、DPPH·、ABTS+·和还原力的影响均较小。槲皮素对ABTS+·呈正相关，相关系数为0.99；对羟基自由基呈负相关，相关系数为0.85。对羟基自由基影响最大的为芦丁。对ABTS+·影响最大的为槲皮素和儿茶素，且槲皮素和儿茶素呈负相关，且相关系数为0.98。对还原力和DPPH·影响最大的为原花青素B2，且还原力和DPPH·呈正相关，相关系数为1。综上可知，槲皮素、儿茶素、芦丁和没食子酸对ABTS+·和羟基自由基清除能力的影响较大，芦丁、没食子酸和原花青素B2对还原力和DPPH·的影响较大，而鞣花酸对抗氧化活性均无较大影响，说明芦丁和没食子酸的含量对抗氧化活性的影响较为明显，且芦丁和没食子酸的相关系数为0.99。

3 结论

近年来，随着对具有抗氧化特性的水果生化含量的研究，人们对水果在人类健康和营养中的重要作用有了更深入的认识。本研究采用UV法和HPLC法测得红树莓冻干粉中总多酚、总黄酮和花青素含量分别为72.2，10.84，0.18 mg/L，6种酚类物质含量高低为原花青素B2>鞣花酸>儿茶素>没食子酸>芦丁>槲皮素。在抗氧化活性实验中，槲皮素、儿茶素、芦丁和没食子酸对ABTS+·和羟基自由基清除能力的影响较大，而芦丁、没食子酸和原花青素B2对还原力和DPPH·的影响较大，而鞣花酸对抗氧化活性均无较大影响，说明芦丁和没食子酸的含量对抗氧化活性的影响较为明显，且芦丁和没食子酸的相关系数为0.99。这些结果突出了红树莓具有良好的抗氧化活性，所获得的冻干粉可以被用作天然着色剂或抗氧化剂，并将其作为稳定和多功能的成分被应用于食品、化妆品和制药工业。由此如果红树莓冻干粉作为功能性食品中的成分，它可能会产生很大的吸引力。