天祝白牦牛出血性败血症病原血清学检测

王 斌，闫海全，王淑芳，郭玉鑫，王福财，郭 嵘，廖世梅

(1.天祝县动物疫病预防控制中心，甘肃 天祝 733299；2.天祝县华藏寺镇畜牧兽医站，甘肃 天祝 733299)

牛出败全称是牛出血性败血症，是感染多杀性巴氏杆菌而引起的败血症和组织器官的出血性炎症为特征的传染病，该菌感染谱很广，家禽、家畜、野生动物都有可能感染，家畜中牛最易感。

牛出败病常呈内源性感染，当秋末冬初、气候突变时，机体对温差产生应激反应，引起机体的抵抗力下降时更易发生。常呈地方性小范围暴发或散发，一年四季皆可发。同种动物间传播速度快，不同种动物间不易传播[1]。病牛临床上分为水肿型、肺炎型和败血型3种，多数感染牛为混合感染，单个型感染的较少[2]。

甘肃省天祝藏族自治县是传统牧业县，畜牧业历史悠久。境内海拔2 040～4 874 m，年平均气温0.3 ℃，天祝白牦牛是天祝县特有的地方畜种，全国农产品地理标志。几乎终年放牧，外界环境对牦牛的健康影响较大。多年来牛出败在天祝白牦牛时有发生，遇到天气突变发病率更高，犊牛病死率高于成年牛。笔者只从上报的疫情中了解到少数牛出败死亡病例，临床症状以肺炎型和败血型为多，潜伏期约5 d。症状表现为发烧怕冷，体温升高到40～42 ℃，食欲不振，精神呆滞，咳嗽，呼吸不畅，鼻液较多，病牛便秘和腹泻交替发生，以腹泻为多数，有的粪便带血，病程7 d左右，剖检病变主要表现在胸腔部位，胸膜和肺发生纤维性炎症，胸腔内渗有大量积液，纤维性或浆液性液体，肺部呈大理石样病变，心包和胸膜粘连，败血型表现为急性败血症，病程很短，症状还没出现就死亡，一般在1～2 d。败血型病理变化为真胃粘膜、肠道粘膜、皮下组织都有出血现象，淋巴结明显水肿，肝肾异常病变。迄今为止全县从没做过牛出败感染率情况普查，因此笔者在全县10个乡镇36个村，80个场点采集了380份牦牛血，用ELISA法检测牛巴氏杆菌抗原，全面了解天祝白牦牛感染牛巴氏杆菌情况。

1 材料与方法

1.1 采 样

选取天祝白牦牛主要分布的打柴沟镇、哈溪镇、石门镇等10个乡镇，场群选取以放牧牛群为主77个，育肥场3个，共380份样品。有的场群已免疫牛出败疫苗，并在有效期内，有的当年未免疫。因为本实验是抗原检测，免疫血样不影响实验结果。采集牛颈静脉血分离血清，保证血清新鲜无溶血。

1.2 检测试剂

牛巴氏杆菌(pasteurella)酶联免疫分析试剂盒，厂家：江苏菲亚生物科技有限公司，LOT NO：2108026。实验原理是用双抗体夹心法测定样品中牛巴氏杆菌表达。

1.3 实验步骤

每板设2个阳性和阴性对照孔，各加50 μL对照液，空白孔1孔，样品孔先加样品稀释液40 μL，再加样品10 μL。加样：将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37 ℃温育30 min；然后将缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，再用同种方法洗涤。显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色10 min。终止：每孔加终止液50 μL，终止反应。测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定在加终止液后15 min以内进行。

1.4 实验有效性判定

阳性对照孔平均值≥1.00；阴性对照平均值≤0.20。

临界值(CUT OFF)计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。

阴性判定：样品OD值<临界值(CUT OFF)者为牛巴氏杆菌阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值(CUT OFF)者为牛巴氏杆菌阳性。

2 结果与分析

10个乡镇牛巴氏杆菌病抗原检测阳性率统计情况见表1。

2.1 统计抗原阳性率

结果(表1)显示，阳性率在0～7.5%之间，平均阳性率为4.47%。这次采样场点多，样品比较广泛，检测结果能代表全县感染情况，从阳性率分析巴氏杆菌阳性率不高，并且有的乡镇感染率为0，但呈现普遍感染。因为以前没做过这样的检测，所以无法判断变化趋势。

2.2 年龄对阳性率影响

按照年龄统计阳性率，结果是17份阳性中，2岁以下牦牛有10头，感染率为5%，2岁以上有7份，感染率为3.88%，说明年幼牛感染率高于成年牛。

2.3 地域分布影响

10个乡镇地理地形有区别，海拔在2 040～4 874 m之间，气候也稍有差异，从检测结果(表1)分析阳性率与地域分布无明显差异。

表1 各乡镇牛巴氏杆菌病抗原阳性率统计情况

2.4 病例检测

采样过程中，石门镇1群95头牦牛有7头表现出咳嗽、食欲减退、体温在40～41.8 ℃之间，鼻镜干燥，结膜发红，还有肌肉震颤现象，疑似肺炎性牛出败，对病死1头采组织病料，作染色镜检，镜下见到大量巴氏杆菌，同时采集同群健康牛和发病牛血样25份(病牛5份)，作酶联免疫分析检测，阳性率为84%(病牛阳性率100%)，结合镜检结果综合诊断为牛出败感染引起发病。

3 讨 论

牛出败为我国二类动物传染病，是需要采取严格控制、扑灭等措施，防止扩散的传染病。平常大家较重视口蹄疫等国家强制免疫病种，对地方性常见病放松了警惕，防疫上存在漏洞，但牛出败是急性，传染性较强的传染病，巴氏杆菌在自然界广泛存在，发病无季节性，当有诱发因素存在，引起动物免疫力下降时，常呈急性发作，在小范围爆发，如果不及时有效治疗，常常会引起牲畜死亡。病牛如果没有及时诊断和处理，会造成突然爆发流行的风险。

从检测结果看，全县19个乡镇调查了白牦牛分布较多的10个乡镇80个场点，各乡镇感染率高低不一，其中2个乡镇为0，最高达到7.5%，说明全县牦牛对牛出败呈普遍易感，平常表现为隐性感染，当有诱发因素存在时激发发病，表现出临床症状。笔者还对比了放牧牦牛和圈养饲喂牦牛，前者阳性率高于后者，这和环境诱发因素较多有很大关系，气温变化或保暖措施不到位等常会诱发内源感染，所以加强放牧牦牛的饲养管理很重要，尤其2岁以下幼牛免疫力低于成年牛，应作为饲养管理的重点。据任广杰等[3]报道，野牦牛与家牦牛杂交的混血牦牛对牛出败的抵抗力强于家牦牛，发病率低于家牦牛。

牛出败的防控要从加强饲养管理、程序化免疫、无害化处理病畜等方面综合入手，合理建造圈舍，降低温度对动物机体的不利影响；平时做好春秋两季牛巴氏杆菌灭活苗的免疫，应免密度达到100%，保护易感动物；养殖过程中要观察仔细，及时发现病畜并有效隔离饲喂。发生疫情时及时上报并做好隔离措施，对健康畜紧急免疫接种，病畜可用抗生素、磺胺类药物等对症治疗[4]，及时清理污染物、排泄物，对病死畜远离水源深埋或焚烧，对污染圈舍和环境用10%石灰乳或其他消毒剂彻底消毒[5-11]，同时加强舍内通风换气，有条件的修筑火墙增加舍温。