阿比多尔对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症及气道黏液高分泌影响的实验研究

康 睿，张亚琼

(1.延安大学附属医院呼吸内科，陕西 延安 716000；2.榆林市中医医院药学部，陕西 榆林 719000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是临床常见的一种以气流受限为主要特征的呼吸系统疾病，该病气流受限呈进行性发展，同时可伴有气道高反应性，患者多表现为肺功能减退，严重影响运动、劳动能力和生活质量[1]。COPD好发于老年群体和慢性支气管炎、肺气肿等肺部疾病患者群体中，近年来由于人口老龄化、环境污染等问题造成我国COPD发病率和病死率不断增加[2]。大量流行病学调查研究发现，气道炎症、气道黏液高分泌与COPD发病密切相关，且持续性的气道黏液高分泌是造成COPD高发病率和患者死亡的独立因素[3-4]。阿比多尔是广谱非核苷类抗病毒药物，目前在甲型、乙型流感病毒感染[5]、新型冠状病毒肺炎[6]治疗中具有良好的效果，在流行性感冒诱发的COPD急性加重期[7]治疗也能显著提高疗效。本研究以烟熏和气管内注射脂多糖法建立的COPD大鼠模型作为研究对象，探讨了阿比多尔对COPD大鼠肺功能、气道炎症和气道黏液高分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：45只SPF级雄性健康SD大鼠，10～12周龄，体重315～330 g，由重庆医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(渝)2018-0003。饲养环境条件：温度 25 ℃，相对湿度 40%～70%，光照强度 15～20 Lux，自由饮水进食。

1.1.2 试剂与仪器：盐酸阿比多尔片(0.1 g/粒，国药准字H20103373)；脂多糖(美国Sigma)；猴王磨砂香烟(烤烟型，焦油量13 mg，烟碱量1.2 mg，一氧化碳量 14 mg，陕西中烟工业公司)；水合氯醛(西亚试剂)；肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、IL-17 ELISA试剂盒(合肥莱尔)；黏蛋白5AC(MUC5AC)和钙离子激活的氯离子通道1(CLCA1)和Toll 样受体4蛋白(TLR4)等兔抗大鼠单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；BCA试剂盒、蛋白质Marker购自美国Thermo Fisher公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；PVDF膜购自德国Millipore公司；RIPA细胞裂解液(上海碧云天)；组织细胞总RNA提取试剂盒、Quanti Nova SYBR Green PCR试剂盒(德国QIAGEN)；反转录试剂盒(TaKaRa)；MUC5AC、CLCA1和TLR4引物合成由上海生工生物工程有限公司提供服务。60 cm×50 cm×40 cm熏烟箱(自制)；Ani Res2005动物肺功能测定仪(北京贝兰博科技有限公司)；光学显微镜(日本Olympus)；普通PCR仪、电泳仪、Chemi DOC XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad)；R3510离心机及移液器(美国Eppendorf公司)；7500荧光定量PCR仪(美国ABI)；RT-6100型全自动酶标分析仪(深圳雷杜)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与处理：将大鼠依据随机数字表法分为对照组、模型组和阿比多尔组，各15例。模型组和阿比多尔组均采用烟熏和气管内注射脂多糖法[8]建立COPD模型，具体操作：建模第1天和第14天采用腹腔注射6%水合氯醛麻醉大鼠，经气管注入200 μg/200 μl脂多糖溶液，并在第2～13天、第15～28天每天上午将大鼠置入熏烟箱内，每次持续吸入15支香烟，每天吸烟1次，每次30 min。造模成功1周后，给予阿比多尔组大鼠3 g/L阿比多尔溶液 1 ml/100 g灌胃；对照组和模型组用生理盐水1 ml/100 g灌胃，三组连续灌胃10 d。

1.2.2 肺功能测试：在灌药治疗1周后，麻醉各组大鼠并固定，切开颈部皮肤，充分暴露气管并插管，使用Ani Res 2005动物肺功能测定仪测定肺活量(FVC)、呼气峰值流速(PEF)、第0.1 s用力乎其容积(FEV0.1)、气道阻力(RI)等肺功能指标。

1.2.3 支气管肺泡灌洗及炎性因子测定：肺功能测试结束后，在大鼠仍在麻醉状态下迅速打开胸腔，血管钳结扎左支气管，将灌胃针头插入器官后注射4 ml生理盐水灌洗右肺，反复灌洗3次，回收灌洗液。在4 ℃ 条件下3000 r/min离心灌洗液10 min，吸取上清液保存在-80 ℃冰箱待测。严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测灌洗液上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、IL-17水平。

1.2.4 Western blot法检测肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4表达：取50～100 mg脑组织，冰上称重后放入EP管中，加入1 ml 预冷的RIPA裂解液(带PMSF溶液)，4 ℃用玻璃匀浆器充分匀浆处理至95%的细胞被破碎，冰浴放置10 min，每隔5 min在漩涡混合仪上振荡30 s。在4 ℃下12000 g离心10 min，留取上清液即为组织总蛋白产物。采用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。根据总蛋白浓度取适量上清液进行SDS-PAGE电泳，80 V电泳30 min后转为120 V继续电泳60 min，电泳结束后转移至PVDF膜上，以蛋白Marker作为参照，按照目标蛋白分子量大小切取条带，分别加入MUC5AC、CLCA1和TLR4一抗，2 ℃过夜孵育。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入二抗室温孵育2 h，ECL显色并曝光。采用Image J图像分析系统，以管家基因蛋白β-actin作为参比计算相对吸光度值。

1.2.5 荧光定量PCR技术检测肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4表达：取适量肺组织，用生理盐水冲洗血迹，冰上称重后放入EP管中，加入1 ml 预冷的RIPA裂解液(带PMSF溶液)，4 ℃用玻璃匀浆器充分匀浆处理至95%的细胞被破碎，冰浴放置10 min，每隔5 min在漩涡混合仪上振荡30 s。使用组织细胞总RNA提取试剂盒提取总RNA。以总RNA为模板采用反转录试剂盒获取cDNA，以cDNA为模板采用Quanti Nova SYBR Green PCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，以β-actin作为参比基因，采用2-△△CT相对定量法计算肺组织中MUC5AC、CLCA1和TLR4表达情况。

2 结 果

2.1 三组大鼠FVC、PEF、FEV0.1及RI比较 三组大鼠FVC、PEF、FEV0.1和RI等肺功能指标比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。阿比多尔组大鼠FVC、PEF、FEV0.1均显著高于模型组，但显著低于对照组；RI显著低于模型组，但显著高于对照组，比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 三组大鼠FVC、PEF、FEV0.1及RI比较

2.2 三组大鼠支气管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平比较 三组大鼠支气管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17等炎性因子指标比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。阿比多尔组大鼠支气管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平均显著高于对照组，但显著低于模型组，比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 三组大鼠支气管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平比较(ng/L)

2.3 Western blot检测三组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4结果比较 三组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4 蛋白相对吸光值比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。阿比多尔组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4 蛋白相对吸光值均显著低于模型组，但显著高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3(图1)。

表3 Western blot检测三组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4表达相对吸光值比较

图1 Western blot检测三组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4表达情况

2.4 三组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相对表达量比较 三组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(均P<0.05)。阿比多尔组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相对表达量均显著低于模型组，但显著高于对照组，比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 三组大鼠肺组织MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

烟熏联合气管注射脂多糖溶液是目前制备COPD模型动物的常用方法，既能模拟人类吸烟造成的呼吸道损害，诱发气道炎症，气道黏液分泌增加；还能模拟细菌感染引起的炎症、咳痰喘和肺功能降低等表现[8]。而且这种联合制备COPD动物模型造模时间短，4周左右即可完成造模，操作简单，对大鼠损伤较小，建模成功率和存活率均较高[9]。本研究通过此法建立COPD大鼠模型，且发现模型组大鼠FVC、PEF、FEV0.1显著低于对照组，RI和支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8、IL-17水平显著高于对照组，提示建模成功，模型组大鼠存在明显的肺功能降低和气道炎症反应。

COPD表现为气道慢性炎症改变， COPD患者支气管肺泡灌洗液、血清等样本中的TNF-α、IL-8水平均显著增加，且急性加重期患者血清TNF-α、IL-8水平增加更为明显，目前临床已经将其作为评估COPD严重程度的重要指标[10-11]。IL-17是由CD4+、CD8+T淋巴细胞表达的一种炎性因子，能够促进TNF-α、IL-8表达和释放，造成气道内中性粒细胞聚集，进而形成气道炎症[12]。阿比多尔除了能够通过降低病毒与宿主细胞融合概率阻断病毒感染外，还能够刺激体液免疫和细胞免疫，进而调节机体免疫功能。现有研究发现，阿比多尔能够调节细胞因子表达，平衡外周血CD4+、CD8+等T淋巴细胞比例，在免疫应答调节中具有重要作用[13]。同时阿比多尔还能诱导干扰素并激活吞噬细胞的作用，可有效减少肺部疾病恶化和炎症反应加剧[14]。本次研究中，阿比多尔组大鼠支气管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平虽然显著高于对照组，但显著低于模型组，这可能是由于阿比多尔能够改善T淋巴细胞比例，进而下调IL-17表达，降低TNF-α、IL-8等炎症因子水平，缓解了气道炎症。

COPD的另一个主要特征是气道黏液高分泌，且气道炎症与气道黏液高分泌相互促进。气道内过度分泌的黏液将严重损害纤毛清除功能和防御功能，加重气道阻塞，患者不能有效清除吸入的细菌、病毒，这给病原菌定制提供有利的条件，造成持续性、反复性感染，进一步加重黏液高分泌[15]。COPD发病早期即可存在气道黏液过度分泌，临床主要表现为痰多、咳嗽。MUC5AC由杯状上皮细胞分泌，是气道黏液的最主要成分，对于气道黏液弹性和黏附特性有重要作用，也是机体抵抗外来刺激、异物侵入的重要防御成分[16]。TNF-α、IL-1β等促炎因子，细菌毒性产物如内毒素，吸烟等均可促进MUC5AC表达，模型制备中脂多糖模拟细菌内毒素，加之香烟烟熏促使大鼠形成气道黏液高分泌。CLCA是参与杯状细胞化生的关键信号分子，其表达上调可引起气道黏液高分泌，且有报道发现通过抑制CLCA1能够有效抑制黏蛋白(MUC)基因表达和黏液产生，并发现COPD患者CLCA1存在表达增强现象[17-18]。TLR4是一种病原分子识别受体，能够与内毒素、脂多糖结合并激活Toll样受体，进而激活核因子κB信号通路，促进炎性因子表达和释放[19]。已有研究发现COPD患者肺组织、支气管肺泡灌洗液中TLR4呈明显高表达状态[20]。本次研究采用Western Blot和实时荧光定量PCR两种技术对大鼠肺组织中MUC5AC、CLCA1、TLR4表达情况进行了检测，结果均表明，阿比多尔组和模型组MUC5AC、CLCA1、TLR4表达水平均显著高于对照组，提示经过烟熏和内毒素处理后大鼠形成了明显的气道黏液高分泌；而阿比多尔组大鼠MUC5AC、CLCA1、TLR4表达水平均显著低于模型组，则提示阿比多尔能够显著改善气道黏液高分泌。在改善气道炎症和气道黏液高分泌下，阿比多尔组大鼠FVC、PEF、FEV0.1均显著高于模型组，说明阿比多尔能够显著改善COPD模型大鼠肺功能。

综上所述，阿比多尔能够显著改善COPD大鼠肺功能，这与阿比多尔能够显著缓解气道炎症和气道黏液高分泌有关，这也为阿比多尔在COPD治疗中的应用提供了理论依据。