35%精甲霜·霜霉盐可溶液剂气相色谱分析方法研究

王 进, 刘雪芬，潘光飞，廖文斌，林怡汝，张俊杰

(浙江禾本科技股份有限公司，浙江 温州 325008)

精甲霜灵(metalaxyl-M)是甲霜灵的R手性异构体，其活性要比S异构体高20倍以上。精甲霜灵的作用机理与甲霜灵相似，都是通过渗透细胞膜抑制病原菌核糖体RNA聚合酶I的活性来抑制病核酸的生物合成[1-2]。精甲霜灵是一种广谱杀菌剂，内吸性强。当药剂喷施到作物上后，能被作物各个器官吸收并传导，可起到保护和治疗的作用。精甲霜灵对霜霉病菌、疫霉病菌和腐霉病菌引起的作物病害的治理效果突出[3]。单一药剂的使用容易诱发病菌的抗药性[4]，因此复配试剂经常作为药剂研发的重点。霜霉威盐酸盐(propamocarb hydrochloride)也是一种广谱杀菌剂，可由霜霉威原药经盐酸酸化制备得到，能够抑制病菌细胞膜成分的卵磷脂和脂肪酸的生化合成，以及抑制菌丝生长、孢子囊的形成和孢子萌发，兼有保护和治疗作用。霜霉威盐酸盐可有效防治霜霉病、疫病、猝倒病等，多使用于黄瓜、番茄、甜椒、马铃薯、烟草等[5]。精甲霜·霜霉盐是一种新型复配制剂，有田间试验对比研究表明，其对辣椒疫病有显著的防治效果[6]。已有的关于精甲霜灵复配制剂的定量大多是采用液相色谱法[7-9]。霜霉威盐酸盐不易气化，可溶于水并以离子形式存在，多采用液相色谱法检测，但是峰型不好，目前对其的气相色谱定量分析的报道也较少[5,10]。

本研究建立了35%精甲霜·霜霉盐可溶剂有效含量测定的方法，利用甲霜灵和霜霉威作为标准品，通过一定的前处理方法和计算方式，采用气相色谱对试样中精甲霜灵和霜霉威盐酸盐进行定量分析。该方法具有操作简单、准确度高、线性关系良好等特点，适用于产品质量的检测控制。

1 实验部分

1.1 精甲霜灵(R)-异构体比值K值的测定

1.1.1 试剂和溶液

正己烷，色谱纯(乐清亿邦仪器设备有限公司)；异丙醇，色谱纯(乐清亿邦仪器设备有限公司)；甲霜灵标样，纯度98.7%(上海农药研究所有限公司)；35%精甲霜·霜霉盐可溶液剂，浙江禾本科技股份有限公司提供。

1.1.2 仪器

分析天平，赛多利斯CPA225D(德国Sartorius)，精度为0.00001 g；高效液相色谱仪，Waters Acquity H-Class/PDA检测器(美国沃特世(waters))；超声波清洗器(PMI-300TD，PRIMA technology Group)；有机微孔滤膜，孔径0.45 μm(MILEDT Technology Co.Ltd)。

1.1.3 色谱工作条件

色谱柱，CHIRALCEL OD-H 4.6 mm×150 mm×5 μm(美国Agilent公司)；流动相，正己烷+异丙醇=85+15(体积)；流量，1.0 mL/min；柱温，35 ℃；测定波长，210 nm；进样量，5 μL；采样时间，30 min；

保留时间：(S)-异构体约6 min，(R)-异构体约22.5 min。

典型的甲霜灵标准品及35%精甲霜·霜霉盐试样的手性高效液相色谱图见图1和图2。

图1 甲霜灵标样正相高效液相色谱图

图2 甲霜灵标样正相高效液相色谱图

1.1.4 测定步骤

1)甲霜灵标样溶液配制。称取含有效成分约0.03 g(精确至0.01 mg)的甲霜灵标样于50 mL容量瓶中，用25 mL异丙醇超声溶解，并用正己烷定容，摇匀。

2)试样溶液配制。称取约0.3g(精确至0.01 mg)的35%精甲霜灵·霜霉威可溶液剂试样于50 mL容量瓶中，用25 mL异丙醇超声溶解，并用正己烷定容，摇匀，于测定前过滤。

3)测定。在1.1.3色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，注入数针标样溶液，直至相邻两针甲霜灵(S)-异构体和(R)-异构体的峰面积相对变化小于1.2%后，按照标样溶液、试样溶液的顺序进样分析。

4)计算。将测得两针试样溶液中精甲霜灵(S)-异构体和(R)-异构体的峰面积分别进行平均。试样中精甲霜灵(R)-异构体的比值K按公式(1)进行计算：

(1)

式中：AS为试样溶液中精甲霜灵(S)-异构体的峰面积平均值；AR为试样溶液中精甲霜灵(R)-异构体的峰面积平均值。

1.2 精甲霜灵、霜霉威盐酸盐质量分数的测定

1.2.1 试剂和溶液

丙酮，分析纯(浙江中星化工试剂有限公司)；氨水，w(NH3)≥25%(西陇科学股份有限公司)；内标物,邻苯二甲酸二乙酯，无干扰分析的杂质(国药集团化学试剂有限公司)；甲霜灵标样,纯度98.7%(上海农药研究所有限公司)；霜霉威标样,纯度99.4%(上海农药研究所有限公司)；内标溶液配制：准确称取邻苯二甲酸二乙酯1.5g于100mL容量瓶中，用丙酮溶解稀释至刻度，摇匀备用。

1.2.2 仪器

气相色谱仪，Agilent GC 8890/具FID检测器(美国Agilent公司); 分析天平，赛多利斯CPA225D(德国Sartorius)，精度为0.00001 g；超声波清洗器(PMI-300TD，PRIMA technology Group)；有机微孔滤膜，孔径0.45 μm(MILEDT Technology Co.Ltd)。

1.2.3 气相色谱操作条件

色谱柱，HP-5 30 m×0.32 mm×0.25 μm毛细管色谱柱(美国Agilent公司)；载气，N2；检测温度，250℃；控制方式，线速率；柱流量，1.5 mL/min；进样方式，分流进样；吹扫流量，3 mL/min；分流比，50∶1；空气流量，300 mL/min；进样量，1.0 μL；氢气，30 mL/min;气化温度，250℃；尾吹流量，30 mL/min；柱温：150℃保持5 min，以20 ℃/min升温至250℃，保持20 min。保留时间：霜霉威约4 min， 邻苯二甲酸二乙酯约7 min，甲霜灵约10 min(见图3和图4)。

1.2.4 测定步骤

1) 标样溶液的配制。准确称取甲霜灵标样0.05 g(准确至0.01 mg)、霜霉威标样0.1g(准确至0.01 mg)标样于10 mL容量瓶中，用移液管移入5.00 mL内标溶液，超声溶解，摇匀。

2) 试样溶液的配制。准确称取含甲霜灵0.05 g(准确至0.01 mg)的试样于10 mL容量瓶中，用移液管移入5.00 mL内标溶液超声溶解，再加入4滴浓氨水将霜霉威盐酸盐转化为霜霉威，充分摇匀，于测定前过滤。

3)测定。在2.2.3色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，注入数针标样溶液，直至两针有效成分和内标物峰面积比相对变化小于1.2%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进样分析。

1.霜霉威标样；2.邻苯二甲酸二己酯；3.甲霜灵标样。

图3 甲霜灵·霜霉威的标准品气相色谱图

1.霜霉威；2.邻苯二甲酸二己酯；3.甲霜灵。

4)计算。将测得的两针试样溶液，以及试样前后两针标样溶液中的甲霜灵(霜霉威)峰面积与内标物峰面积的比值分别进行平均。其中，精甲霜灵质量分数x1按公式(2)计算，霜霉威盐酸盐的质量分数x2按公式(3)计算。

(2)

(3)

式中：P1为甲霜灵标准品的纯度，以%表示；r1为标样溶液中甲霜灵和内标物峰面积比的平均值；r2为试样溶液中甲霜灵与内标物峰面积比的平均值；m1为标样溶液中甲霜灵标准品的称样质量(g)；m2为试样质量(g)；K为试样中精甲霜灵(R)-异构体的比值。P2为霜霉威标准品的纯度，以%表示；r3为标样溶液中霜霉威和内标物峰面积比的平均值；r4为试样溶液中霜霉威与内标物峰面积比的平均值；m3为标样溶液中霜霉威标准品的称样质量(g)；m2为试样质量(g)；224.7为霜霉威盐酸盐的相对分子质量；188.3为霜霉威的相对分子质量。

2 结果与分析

2.1 内标物的选择

经过优化后的甲霜灵、霜霉威与邻苯二甲酸二乙酯在试验条件下，出峰时间相近，分离度好，且相互之间无干扰，符合内标物的标准，可以满足对精甲霜·霜霉盐可溶液剂进行定量分析的要求。

2.2 分析方法的线性相关性的测定

分别称取不同质量的甲霜灵和霜霉威标样于10 mL容量瓶中，用5.00 mL内标溶液超声溶解，摇匀，配制成不同质量浓度的甲霜灵(或霜霉威)系列标样溶液。以甲霜灵(或霜霉威)质量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到甲霜灵和霜霉威的线性相关曲线。甲霜灵的线性方程为y=0.0139x-0.0154，相关系数r=1.0>0.99。霜霉威的线性方程为y=0.0119x-0.0416，相关系数r=0.9999>0.99，因此均在线性范围内(见图5和图6)。

图5 甲霜灵的线性关系图

图6 霜霉威的线性关系图

2.3 分析方法的精密度试验

按照1.2.3色谱条件，对同一试样平行测定6次。甲霜灵测定结果的标准偏差为0.04%，相对标准偏差RSD为0.37%，重复性测定结果小于0.67×2(1-0.5×lgC)(修订后的Horwits公式)1.88%；霜霉威测定结果的的标准偏差为0.09%，相对标准偏差RSD为0.40%，重复性测定结果小于0.67×2(1-0.5×lgC)(修订后的Horwits公式)1.69%。结果表明(表1)，同一批次产品的检测结果重复性良好，检测结果可以接受，能够满足日常检测工作的需要。

2.4 分析方法的准确度测定试验

根据1.2.4溶液制备方法，分别称取试样溶液一半的试样称样量和标样溶液一半的称样量，用移液管移取5 mL内标溶液，再加入4滴浓氨水，超声溶解过滤。按照上述(1.2.3)分析方法分别测定其中的甲霜灵和霜霉威的总的质量，并计算其回收率，甲霜灵和霜霉威的平均回收率分别为100.26%和99.53%，符合回收率标准范围98%～102%。结果见表2。

表1 分析方法的精密度试验结果

表2 分析方法准确度测定试验结果

3 结论

本试验建立了35%精甲霜·霜霉盐可溶液剂中有效成分的气相色谱分析方法。结果表明：35%精甲霜·霜霉盐可溶液剂在测试质量浓度范围内线性关系良好，方法准确度和精密度高。该方法采用常用的甲霜灵和霜霉威为标准品，并且在同一试验条件下能够分离试样中有效成分，具有操作简便、快速的特点，是产品质量控制较为理想的分析方法。