肺泡微结石症1例家系基因分析

胡秋芳 张 娟 盛天昕 杨小东 陈司汉

1.乐山职业技术学院医护系，四川乐山 614000；2.四川省德阳市人民医院呼吸内科，四川德阳 618000；3.四川大学华西医院呼吸内科，四川成都 614000

肺泡微结石症是（pulmonary alveolar microlithiasis，PAM）以两肺肺泡内钙、磷微小结石沉积及继发肺间质纤维化改变为特征的一种罕见肺部疾病。该病有家族遗传倾向，多以常染色体隐性方式遗传，其发病与SLC34A2（solute carrier family 34 member 2）基因突变有关[1]。该基因编码Na 依赖的Pi 转运蛋白NaPi-Ⅱb，该蛋白主要表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞，主要作用是从肺泡液中吸收无机磷用于肺泡表面活性物质的合成。SLC34A2 基因突变后使NaPi-Ⅱb 蛋白质形成异常，导致肺泡内钙磷转运失调，无机磷积累，进而引发磷酸钙盐沉积[2-3]。随着近年来对该病认识的增加，至今为止已有30 种不同的SLC34A2 基因变异被报道[3]。我国报道的SLC34A2 基因突变多为外显子8 突变[4]。现报道1例PAM 患者的SLC34A2 基因突变特点。

1 病例资料

1.1 一般资料

患者男，30 岁，自幼常因“感冒”于当地医院就诊，行胸片检查考虑“肺结核”，未进一步检查及规律抗结核治疗，一般予以输液治疗几天后症状缓解。3年前患者反复出现咳嗽、咳痰，活动及感冒后感气紧，行胸部CT 检查提示双肺弥漫颗粒状结节影，余无特殊。患者父母无近亲关系，家系中父亲所有弟弟均未婚，父亲妹妹与母亲弟弟结婚，第三代包括先证者共4 人（家系图谱见图1）。其他家系成员无类似症状。

图1 病例家系系谱图

1.2 体格检查

查体：体重62 kg，身高168 cm，唇无发绀，无杵状指，心界正常，心律齐，各瓣膜区未闻及杂音。双肺呼吸音稍低，未闻及干湿啰音，双下肢无水肿。

1.3 辅助检查

血钙：2.07 mmol/L，肺功能：①FVC 为4.01 L（与预计值之比为87.9%）；②FEV1为13.76 L（预计值之比为97.4%）；③FEV1/FVC 为94%；④BR 轻度降低，DLCO 中度下降，VEDA＞10 L；⑤患者弥散功能中度降低，通气储备功能轻度下降，过度通气，肺功能中度受损。胸部CT 检查提示：双肺弥漫高密度结节影，以中下肺为主，呈“暴风雪”或“沙暴”样改变，提示肺泡微结石症；双肺间质改变，双肺胸膜增厚、粘连、钙化；纵膈淋巴结增大（图2）。在排除粟粒型肺结核、尘肺、肺含铁血黄素沉着症等疾病，根据患者病史、典型临床表现及实验室检查结果，拟诊为PAM。

图2 患者胸部CT 肺窗及纵膈窗

1.4 基因检测资料

经知情同意后，患者及在世家族4 名成员均用乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管抽取外周静脉血4 ml，DNA 提取采用基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。DNA抽提后用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测纯度及含量。对SLC34A2 基因13 个外显子中的12 个外显子设计引物进行PCR 扩增，将PCR 扩增产物送至上海生工生物公司进行测序分析。首先检测患者12 个外显子的编码区和剪接位点的突变，确定可能的突变位点，然后针对突变位点再检测突变在其家族成员中的分布情况。另取100 例无关正常人外周血DNA 作为对照。

1.4.1 PCR 扩增结果 SLC34A2 基因2-13 号外显子成功扩增（图3）。

图3 SLC34A2 基因2-13 号外显子扩增产物

1.4.2 基因检测结果 该PAM 家系成员基因经双向测序发现，患者SLC34A2 基因突变为外显子8 突变c.910A＞T（p.K304X）（图4）；SNP 位点有2 个突变即内含子12 的rs199563183 (p.Y455H)（图5）和外显子13 的rs3733545（图6）同时出现突变。其父亲外显子8 c.910A＞T（p.K304X）存在突变，母亲SNP 位点也有以上2 个突变。家系中患者舅舅无突变位点。

图4 外显子8 突变位点测序图

图5 内含子12∶rs 199563183 突变位点测序图

图6 外显子13∶rs3733545 突变位点测序图

2 讨论

PAM 是一种罕见的以磷酸钙盐颗粒在双肺肺泡内沉积为特征的疾病，由SLC34A2 基因变异引起。于1868年最早由Marcello 报道描述，之后全世界各大洲均有陆续报道，目前报道的病例数不到1100 例[5-6]，其中以土耳其和欧洲多见。PAM 患者早期症状不明显，多在30～40 岁逐渐出现干咳、呼吸困难、咯血、气胸及肺心病等症状。临床上主要结合X 线、胸部CT及肺活检对PAM 进行确诊，患者双肺可见弥漫性砂粒样钙化结节影，且随病情进展钙化灶逐渐增多并出现聚集融合，呈现“暴风雪”改变。近年来很多研究证实PAM 具有家族遗传倾向是一种常染色体隐性遗传病，其家族史报道频率为32%～61%[2，7]。遗传病例报道中不存在性别倾向，但散发病例以男性为主（57.7%）[7-8]。

PAM 发病与SLC34A2 基因突变有关，该基因属于溶质转运蛋白家族SLC34 的成员之一，位于染色体4p15.31-p15.2，全长21033bp，包括13 个外显子[9-10]，除第1 个外显子是非编码，其余12 个均为编码外显子。SLC34A2 在Ⅱ型肺泡上皮细胞高表达，其编码的转运蛋白NaPi-Ⅱb 含有690 个氨基酸的多次跨膜蛋白，至少有8 个跨膜α 螺旋区组成，研究推测胞质内侧和外侧各有一短环具有转运通路的重要功能区域[11]，其主要作用是从肺泡液中吸收无机磷用于肺泡表面活性物质的合成。当SLC34A2 基因突变后会导致该转运蛋白形成异常，从而使肺泡内钙磷转运失调，磷酸盐堆积无法清除，从而为微结石的形成提供条件。Saito 等[12]通过小鼠模型研究发现Ⅱ型肺泡上皮细胞缺少NaPi-Ⅱb 可导致肺泡内微结石形成及进行性限制性肺疾病的发生。

目前有许多关于SLC34A2 基因突变的文献报道，其突变位点有外显子1、2、3、4、6、7、8、11、12 和13，且分布具有种族或地域倾向[13]。如土耳其病例报道中除外显子7 和8 未发现突变，其他的外显子均有突变，日本病例中主要是外显子7 或8 突变，而在中国的病例报道中多在外显子8 出现突变，仅有1例突变在外显子6[14-15]。本病例也呈外显子8 突变，但与以往报道不同的是该患者SNP 出现新的两个突变位点即内含子12、外显子13。其中外显子8 的突变位点c.910A＞T 来源于父系，即cDNA 的第910 号密码子由A→T,从而使氨基酸AAA（赖氨酸）→TAA，提前出现终止密码子，以致不能产生正常功能蛋白从而导致肺泡微结石的形成。基因检测发现新突变的位点内含子12 及外显子13 的3′-UTR 区来源于母系，该位点的突变类型尚未报道过。进一步分析发现rs3733545 位于13 号外显子3′-UTR 区,等位基因二元状态为G/T，G 为祖先型等位基因，本例患者的等位基因G 来自母亲，T 来自父亲。由于该SNP 位点的两种等位基因频率相近，因此推测其致病的可能性较小。而rs199563183位于12 号内含子第26 位碱基,等位基因二元状态为G/A，G 为祖先型等位基因，等位基因A 存在极低的群体频率，有潜在致病的可能，患者该位点的等位基因A 来自母亲，与c.910A＞T 来源于不同的单体型，存在致病的可能性。通过家系基因分析看出，父亲有外显子8 的突变，母亲有内含子12 的突变，但父亲与母亲均未发病，而患者完全符合PAM 的特点，由此可见p.K304X 和p.Y455H 的突变可能共同引起了蛋白功能的改变，导致患者自幼发病，病情呈进行性发展的特点。

3 结论

PAM 是一种罕见的肺部疾病，以磷酸钙盐颗粒在双肺肺泡内沉积为特征，有家族遗传倾向，多呈常染色体隐性遗传方式发病。其中SLC34A2 在PAM 的发病过程中发挥着重要的作用，对SLC34A2 基因的研究可能成为PAM 精准基因诊治的突破点，其是否存在复合杂合突变致病的可能有待进一步探索。中国PAM 患者突变位点更倾向于外显子8，而外显子8 的c.910A＞T 突变可能用于中国可疑PAM 患者的临床基因筛查或治疗靶点。