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基于形态和分子系统学对荒漠生羊肚菌的鉴定

2022-04-13赵振西杨梅王国庆夏占峰徐彪

塔里木大学学报 2022年1期
关键词:羊肚生境荒漠

赵振西,杨梅,王国庆,夏占峰,徐彪 *

(1塔里木大学生命科学与技术学院/塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室,新疆 阿拉尔 843300)

(2阿克苏地区林业发展保障中心,新疆 阿克苏 843006)

(3托木尔峰国家级自然保护区管理局,新疆 阿克苏 843006)

(4仲恺农业工程学院植物健康创新研究院,广东 广州 510225)

羊肚菌(Morchella),隶属子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Pezizomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellasceae)。因菌盖多为不规则且呈蜂窝状,形态酷似羊肚,故称羊肚菌[1]。其肉质脆嫩可口,风味独特,富含大量人体必需氨基酸、多种维生素和矿质元素,是一种世界公认的珍贵、稀有食用菌[2]。在欧洲,羊肚菌被认为是仅次于块菌的美味食用菌;北美人则将其作为食用菌中的佳品;在我国除作为食用菌品种外,《本草纲目》中曾有记载“甘寒无毒,益肠胃,化痰利气”的药用功效[3]。其食药用价值在国内外备受追捧,市场需求量日益增加。近年来,虽然人工栽培羊肚菌的技术得到突破,市场前景被业内广泛关注,然而,人工栽培产量不稳定是当前制约羊肚菌产业发展的重要瓶颈[4-5]。如何科学开发、利用和保护野生资源,寻找优良易于栽培的品种,是一个亟待解决的问题。

新疆地处我国西北干旱区,分布着大量独特的生物资源,已经报道的野生羊肚菌有:黑脉羊肚菌(M.angusticeps)、高羊肚菌(M.elata)、小羊肚菌(M.deliciosa)、尖顶羊肚菌(M.conica)、粗柄羊肚菌(M.crassipes)、羊肚菌(M.esculenta)、半开羊肚菌(M.semilibera)等[6-9],大多分布在乌鲁木齐、伊犁、石河子、阿勒泰等北疆林带中[10-15]。然而,南疆地区作为新疆主要地区之一,其野生羊肚菌资源的种类、数量以及生境的调查研究却很少。

2018年4—5月期间,在新疆阿拉尔地区部分荒漠果园中发现野生羊肚菌,其分布于荒漠生境较为罕见。为明确该物种的分类地位,本研究通过形态学特征观测,联合ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α基因序列分析,对采自新疆南疆荒漠地区野生羊肚菌进行鉴定,以明确该物种的分类地位和生态分布,为开发利用本地资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试野生羊肚菌于2018年4—5月采集于新疆阿拉尔荒漠苹果园(81°17′19″E,40°32′46″N),凭证标本保藏于塔里木大学菌物标本馆(HMUT 7691,HMUT 7692)。

1.2 实验方法

1.2.1 形态观测

对荒漠果园野生羊肚菌进行现场拍照,观察、记录并测量新鲜子实体具有分类价值的结构[16]。用3%的KOH溶液作为浮载剂,对干燥标本进行徒手切片[17],使用显微镜(Nikon ni-E,Nikon,Japan)观测其微观形态特征(包括子囊、孢子等)。

1.2.2 DNA的提取

用无菌刀片切取约50~100 mg子实体的内部组织,置于灭菌的1.5 mL离心管,加入2~3粒3.5 mm大的无菌钢珠,经MP Fastprep-24样本制备系统(MP Biomedicals,USA)组织粉碎,采用E.Z.N.A.TM Fungal Mini Kit试剂盒(OMEGA Biotek,USA),按照试剂盒操作说明提取DNA,基因组DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,置-20℃的冰箱内保存备用。

1.2.3 PCR扩增及检测

PCR扩增采用25 μL体系,其中2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,引物各 1 μL(10 μmol/L),DNA 模板1 μL,用ddH2O补齐。5个标记基因序列扩增引物(如表1所示)。ITS序列PCR扩增反应程序为:95℃预变性3 min;94℃变性40 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。LSU序列PCR扩增反应程序为:94℃预变性1 min;94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃延伸10 min[18]。rpb1、rpb2和ef1-α序列的PCR反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min[19]。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,目的条带送往上海生物工程有限公司进行正反向测序。

表1 PCR和扩增引物

1.2.4 系统发育分析

供试样本测序获得的序列,使用Seqman v.7.l.0软件分别进行拼接和校准后提交至GeneBank,并在NCBI中进行Blast比对分析选用序列(如表2所示);以变红羊肚菌(Morchella rufobrunnea)为构建系统发育树的外群;使用MAFFT v.7.47进行多序列比对,经PhyloSuite.v.1.1.14软件进行联排,获得5个基因的联合矩阵;联合矩阵提交至CIPRES在线服务平台(https://www.phylo.org),经Mrmodeltest 2.3[23]选择最佳模型,使用 RAxML-HPC2 on XSEDE(8.2.12)[24]和MrBayes on XSEDE(3.2.7a)[25]分别构建系统发育树。系统发育树使用FigTree 1.4.3查看编辑。

表2 本研究中的参考样本及5个基因的登录号

续表2

2 结果与分析

2.1 分子系统发育分析

供试样本经测序,所得基因序列长度分别为ITS:1 036 bp,LSU:1 023 bp,rpb1:757 bp,rpb2:725 bp,ef1-α:1 013 bp(如图1所示)。基于 ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α联合矩阵,采用最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树,其拓扑学结构一致(如图2所示),供试样本属黄色羊肚菌支系(Esculenta Clade),与泛美羊肚菌(Morchella americana)聚为同一支,支持率为97%/1.00(ML/BI)。

图1 泛美羊肚菌(Morchella americana)基因组DNA ITSLSU-rpb1-rpb2-ef1-α序列扩增结果

图2 基于ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α联合矩阵采用最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树

2.2 形态描述

子实体中等,菌盖长4~8 cm,宽3~6.5 cm,常见卵圆形至近球形,顶端凸出或呈钝锥形,偶见近圆形,表面多凹坑,且不规则,灰棕色至棕黄色。菌柄长5~10 cm,宽2~5 cm,常见棍棒状或近棍棒状,白色至淡黄色,表面分布白色或淡黄色颗粒,中空,基部膨大,并有显著的粗凸隆起(如图3A、3B所示)。子囊孢子椭圆形,表面光滑,透明,无油滴;子囊圆柱形,透明,常见8个孢子(如图3C、3D所示)。

图3 供试样本形态观察

3 讨论

Morchella americana是世界分布较为广泛的种[26-27],由于分类标准的不统一,同一物种在不同地区常赋予不同名称,同物异名现象普遍。在北美,KUO M等[28]曾以M.esculentoides对其报道;在欧洲,CLOWEZ P 等[29]以 M.rigida进行描述,而KELLNER 等[30]则将其记载为 M.esculenta;基于LSU、rpb1、rpb2和ef1-α这4个基因的核苷酸序列,O’DONNELL K等[31]利用多基因谱系一致性系统发育学物种识别法(GCPSR),将羊肚菌属划分为黄色羊肚菌支系(Esculenta Clade)、黑色羊肚菌支系(Elata Clade)和变红羊肚菌支系(Rufobrunnea Clade),并采用了类群缩写+数字的方法来命名Esculenta支系(如Mes-n)和Elata支系(如Mel-n)。DU X H等[27,32]对中国各地区采集的M.esculenta和M.esculentoides样本进行研究并对其物种名称进行了规范。本研究综合形态特征和多基因系统发育分析,明确分布于荒漠生境中的野生羊肚菌与O’DONNELL P等[31]报道的系统发育种Mes-4一致,但子实体较其偏小,菌盖近球形居多,成熟时颜色呈黄色或浅灰色,有时菌盖边缘出现浅红色至红棕色;菌柄基部膨大,且脊凸起显著。

目前,已记载M.americana的生境主要分布于榆树林、杨树林、河岸旁或林地火烧地中,偶有发生在针叶林内[28-30,32],而分布于荒漠生境则未见报道。M.americana在荒漠生境中分布,进一步表明该种的生态适应性强或可能是长期适应性进化的结果。利用该种在特殊生境的适应性,可为开发利用本地野生羊肚菌资源进行人工栽培提供重要的指导。

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