乌药matK基因的生物信息学及多样性分析

袁莉霞，王芙蓉，刘 姝，孙 妍，楼天灵

（浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100）

乌药［Lindera aggregate（Sims）Kosterm］为新“浙八味”之一，因产于浙江天台，故名台乌药，其块根有行气止痛、降脂、护肝等功效［1，2］。由于道地乌药的使用量日趋增多，且缺乏集中化保护，使得道地乌药蕴藏量日趋减少，因此集约化管理迫在眉睫。据《本草纲目》记载，“其直根者不堪用”［3］，且其生长年份较长，因此在种质选取中存在较大难度。

DNA条形码技术已广泛用于各物种分类鉴定、亲缘性及多样性分析等。该技术不受形态和发育状态的影响，准确度高，分类依据可靠，在植物鉴定中已取得显著成效［4-6］。matK为植物DNA条形码的标准序列之一，能够有效对植物属间及属以上级别进行鉴定［7］，对近缘性物种也有较好的分辨能力［8］。滕艳芬等［9］通过分析同属间5种石斛的叶绿体matK基因序列，成功将正品与混淆品区分开。刘静等［10］通过不同的石斛及密花石豆兰的matK序列分析发现，matK基因可用于种及变种之间的鉴别。郑辉等［11］以ITS2+matK序列对峨眉山区唇形科药用植物进行鉴定，发现ITS2+matK序列能够快速、准确鉴定并阐明物种之间的亲缘关系。Alaklabi等［12］利用叶绿体matK和质体rbcL基因进行研究发现，该基因序列可用于芦荟及其近缘物种的鉴定。王瑞娴等［13］利用matK序列对7份桑叶进行聚类分析，结果表明桑树品种间的遗传多样性低于其他植物。

目前，matK基因在乌药鉴定中的应用尚未见报道。本研究从生物信息学角度对乌药matK基因编码蛋白进行分析，并通过序列聚类方法，完成遗传进化及多样性分析，为乌药种质资源鉴别、分类及多样性研究提供参考。

1 材料方法

1.1 试验材料

从NCBI获取的11种山胡椒属matK基因序列为研究对象，这11个物种分别为乌药（Lindera aggregata），登 录 号：AB442057.1；桂 皮 钓 樟（Lindera benzoin），登录号：MG220997.1；香叶树（Lindera communis），登录号：AF244405.1；绿叶甘植（Lindera fruticosa），登录 号：AF244405.1；黑壳 楠（Lindera megaphylla），登录号：AF244404.1；滇粤山胡椒（Lindera metcalfiana），登录号：AF244403.1；三桠乌药（Lindera obtusiloba），登录号：AF244402.1；山橿（Lindera reflexa），登录号：AF244401.1；天全钓樟（Lindera tienchuanensis），登录号：AF244399.1；山胡椒（Lindera glauca），登录号：AB442056.1；三股筋香（Lindera thomsonii），登录号：AF244400.1。

1.2 数据分析

利用NCBI ORFfinder在线工具对乌药matK基因进行分析，通过DNAman软件和ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测编码氨基酸；利用Protscale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl？1）、SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）及TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析乌药matK蛋白的亲/疏水性、信号肽及跨膜结构域；利用GOR IV（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）和SWISS-MODEL（http：//www.swissmodel.expasy.org/）预测乌药matK蛋白的二、三级结构；运用MEGA7软件对乌药等11种matK基因序列构建进化树。

2 结果与分析

2.1 开放阅读框及氨基酸预测

利用NCBI ORFfinder对乌药matK基因的开放阅读框进行分析，结果如图1所示。乌药matK基因序列长度为1 628 bp，包含14个开放阅读框，其中ORF1的长度为1 545 bp，起始密码子位于1 bp的位置，终止密码子位于1 524 bp的位置。利用DNAman对matK基因编码的氨基酸序列进行预测，结果显示其所编码的氨基酸个数为507个（图2）。

图1 乌药matK基因的开放阅读框分析

图2 乌药matK基因及编码氨基酸序列

通过ProtParam分析发现，乌药matK的分子式为C2757H4209N743O735S12，相对分子质量为59 839，其中Leu占比最高，为12.23%（62/507）；其次为Ser、Ile和Phe，分 别 为11.64%（59/507）、8.28%（42/507）和8.09%（41/507）；Met和Cys占比最低，均为1.18%（6/507）（图3）。

图3 乌药matK的氨基酸组成

2.2 理化性质预测

乌药matK的一级结构分析发现存在极性氨基酸，这些氨基酸对高级结构一定有影响。利用Protscale对编码的氨基酸序列进行亲/疏水性分析，结果表明该蛋白的亲水指数为-0.200，为亲水蛋白（图4）。利用SignalP4.1对matK序列的信号肽预测分析发现，该蛋白第8号位上的氨基酸S值最大，为0.486；第21号位上Y值和C值均最大，分别为0.307和0.242；S值平均为0.385，小于0.5，这表明该蛋白不存在信号肽（图5）。通过对matK跨膜预测发现，该蛋白膜内外的比例为100∶1（图6），表明该蛋白不具备细胞间信号传递的能力。

图4 乌药matK的亲/疏水性

图5 乌药matK的信号肽预测

图6 乌药matK的跨膜结构预测

2.3 二、三级结构预测

通过GOR IV分析发现，在乌药matK的二级结构中，α-螺旋（H）为182个，占35.90%；延长线（E）为75个，占14.79%，随机线圈（C）为250，占49.31%（图7）。通过SWISS-MODEL对乌药matK三级结构预测发现，在三级结构中，随机线圈分布最多，其次为Alpha螺旋，这与二级结构的预测结果相一致（图8）。

图7 乌药matK的二级结构

图8 乌药matK的三维结构

2.4 系统进化树

以NCBI中获取的11种matK基因序列为对象，通过MEGA7软件构建进化树（图9），结果表明，该进化树主要分为3个类群，乌药（Lindera aggregata）与桠乌药（Lindera obtusiloba）、三股筋香（Linderathomsonii）在第2个类群，表明乌药与这2个物种间亲缘性较高；山胡椒（Lindera glauca）与乌药亲缘关系最远。

图9 乌药matK基因的系统进化树

3 小结与讨论

matK基因进化速度与rbcL基因相比较慢，而略快于ITS，是目前最常用的DNA条形码序列，已被广泛应用于中药鉴定［14-16］。林晓霞等［17］通过matK和rbcL序列对采集到的22份铁皮石斛进行了系统进化分析和种质的鉴定，结果发现matK分析得到的系统进化关系具有更高的遗传多样性；Asahina等［18］通过matK和rbcL序列对石斛进行鉴定，同样发现rbcL序列的鉴定能力不如matK序列。熊哲铭等［19］通过matK序列对5种阴地蕨属（Botrychium）药用植物进行了种间亲缘关系分析。目前，尚未见matK基因在乌药上的研究。

本研究发现，乌药matK基因所编码的蛋白开放阅读框大小为1 545 bp，编码的氨基酸有20种，共507个，其中占比最高的氨基酸为Leu，最低的为Met和Cys。该蛋白不稳定指数为52.66，亲水指数为-0.200，为亲水蛋白。该蛋白不存在信号肽，且不具备细胞间信号传递的能力。此外，通过11种山胡椒属matK基因的进化树结果发现，乌药与三股筋香的亲缘性最高，与山胡椒的亲缘性最远。该研究可为乌药的种质资源鉴别及系统进化分析提供参考依据。