卵黄抗体在水产养殖病害防治中的应用
2022-04-13俞晶晶萧枪枪郑晨阳赵轩林晨韬
俞晶晶 ，萧枪枪 ，郑晨阳 ，赵轩 ，林晨韬 ，3*
（1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117；2.福建师范大学南方海洋研究院，福建省特色海洋生物资源可持续利用重点实验室，福建 福州 350117；3.福建师范大学海洋生物医药与制品产业化开发技术公共服务平台，福建 福州 350117）
我国作为水产养殖大国，每年的水产品产量约占世界水产养殖产量的70%，位居世界第一，也是世界上唯一养殖量大于捕捞量的国家。但由于水产动物的集约化养殖，导致水环境日益恶化，水产动物病害频繁发生，造成了巨大的经济损失，因此防控和治疗水产动物疾病十分重要。抗生素能有效地防治水产养殖中的细菌性疾病，但长期使用后，也暴露出病原菌产生耐药性及药物残留等问题，滥用抗生素不仅污染水体还会危害人体健康。2020 年7 月国家颁布了饲料“禁抗令”，禁止饲料中添加含促生长类药物，禁令的实施促进了抗生素替代品的研制。目前常见的抗生素替代品有益生菌、中草药、噬菌体、免疫糖类、饲料酶制剂以及卵黄抗体（IgY）等，其中卵黄抗体因具有不产生耐药性、制备简单、产量大、稳定性好、符合动物福利要求、不激活哺乳动物的补体系统等优势，越来越受到人们的关注。
卵黄抗体是一种免疫球蛋白，主要存在于禽类、两栖动物以及爬行动物的血清中，目前研究最多的是鸡的卵黄抗体。1893 年，Klemperer首次证实了对破伤风毒素的免疫力可以从母鸡身上转移到小鸡身上，即蛋鸡经过抗原免疫后，产下鸡蛋的蛋黄中存在特异性抗体。1969 年，Leslie 等对鸡的免疫球蛋白结构和功能进行研究后，将其命名为卵黄抗体。随着科研技术的发展以及生产领域的扩大，人们对抗体的需求量越来越大，也更重视对实验动物的保护，卵黄抗体逐渐被科研人员注意到，其相关研究报道也越来越多。近年来，卵黄抗体技术与基因工程技术、免疫检测技术、磁珠技术、噬菌体展示技术等多种当前主流的抗体技术相结合，应用于病原体检测和诊断、动物疾病治疗、食品工程、新药研发以及快速大量生产科研用抗体等方面。现从卵黄抗体的基本特性及其在水产养殖病害防治中的应用等方面进行归纳总结，以期为今后卵黄抗体的研究及应用提供参考。
1 卵黄抗体的基本特性
1.1 分子生物学特性及理化性质
卵黄抗体由2 条相同的重链和2 条相同的轻链组成，通过二硫键进行连接，分子质量约为1.8×10u，其中重链分子质量约为6.5×10u，轻链的分子质量约为 2.5×10u，轻链由 1 个可变区（V）和1 个恒定区（C）组成，重链由 1 个可变区（V）和 4个恒定区（C，C，C，C）组成。卵黄抗体的重链没有铰链区，所以抗原结合活性会受到一定的影响，还可能存在空间阻位，但这恰好增加了它的稳定性，因此卵黄抗体具有较好的耐热、耐酸和耐酶解的能力。卵黄抗体的等电点约为5.1，由于卵黄抗体处在富含脂质的环境中（蛋黄），因此其疏水性较高。
卵黄抗体的活性可受温度、pH 值和消化酶的影响。温度为60~65 ℃时，卵黄抗体生物活性稍稍降低，温度 >70 ℃时，15 min 后卵黄抗体活性会明显下降。一般而言，低温状态下，抗体活性变化较小，卵黄抗体可长期保存。研究结果显示，温度为4 ℃时，卵黄抗体可保存5 年，室温下则可保存6 个月。此外，在卵黄抗体中加入葡萄糖、甘露糖等糖类，可增加卵黄抗体的热稳定性。pH 值对卵黄抗体的活性影响表现为4.0
1.2 卵黄抗体的产生及作用机理
当禽类受到外来抗原的免疫刺激后，法氏囊中的B 淋巴细胞就会分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体通过识别结合到卵黄膜表面受体上，通过主动转运的方式转移到蛋黄中并积累，从而形成卵黄抗体。目前，已报道的特异性卵黄抗体受体主要有3 种，分别为 FcRY、CHIPR-AB1 和 ggFcR。
卵黄抗体可抑制特定病原菌的生长，但其作用机制一直存在争议。目前，被认可的作用机制主要为以下5 种。（1）卵黄抗体直接作用于细菌细胞壁，使其细胞的完整性遭到破坏，从而抑制病原菌的生长，Xu 等研究显示，相较于非特异性卵黄抗体，用特异性卵黄抗体处理过的爱德华氏菌2CDM001 表面结合了更多的免疫金颗粒，且空白对照组中细菌表面未发现免疫金颗粒。这较好得证实了该作用机制；（2）卵黄抗体直接作用于细菌菌毛，使病原菌不能黏附细胞，从而阻断感染。Wang 等研究结果显示，感染大肠埃希菌K88 的仔猪口服特异性卵黄抗体后，黏附在其空肠和回肠上的细菌数量显著减少，因此认为，特异性卵黄抗体能够阻止大肠埃希菌K88 黏附在仔猪的空肠和回肠黏膜上，并可显著减少结肠内容物中大肠埃希菌数量和肠毒素表达；（3）卵黄抗体可增强巨噬细胞的吞噬活性，帮助机体更有效地清除有害物质。Qin 等研究结果显示，特异性卵黄抗体可通过增强诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）吞噬细胞氧化酶的表达来增加巨噬细胞介导的呼吸爆发，即增加一氧化氮和超氧阴离子的产生，从而保护宿主免受微生物侵袭。（4）卵黄抗体可作用于病原菌产生的内毒素（LPS）。LPS 是革兰氏阴性菌代谢过程中分泌的一种外膜物质，可以引起发热、细胞及组织损伤、休克甚至死亡等；（5）卵黄抗体可在消化酶的作用下分解为小肽，并结合于病原菌的黏附因子，使得病原菌不能黏附易感细胞，进而丧失致病性。
1.3 卵黄抗体的分离提取和纯化
鸡的卵黄中主要成分为水、脂肪和蛋白质，其占比分别为48%，30.5%和17.8%，其中蛋白质与脂肪结合形成脂蛋白，不与脂肪结合则为水溶性蛋白，水溶性蛋白包括α、β 和γ 3 种活性蛋白，卵黄抗体为γ 活性蛋白。从卵黄中获得卵黄抗体包括分离和提取，其中分离的原理是去除卵黄中的脂肪以及脂蛋白，获得水溶性组分，常用的分离方法有水稀释法、三氯甲烷萃取法和聚乙二醇法等。提取则是将大量的卵黄抗体从水溶性组分中提取出来，常用的提取方法为水稀释法和硫酸铵沉淀法。为了满足不同的使用目的，可将提取出来的卵黄抗体进行纯化，常见方法有离子交换法、凝胶过滤法和亲和层析法等。
2 卵黄抗体在水产养殖病害防治中的应用
目前，我国水产养殖病害种类有200 多种，常见病害有几十种，其中细菌性疾病占比为57.63%，病毒性疾病占比为11.02%。在水产养殖病害防治中，卵黄抗体对细菌性和病毒性疾病都有很好的防治作用。卵黄抗体使用方式包括口服、注射和浸泡，根据不同的情况可选择不同的使用方式，以达到最好的免疫效果。其中注射的方式最直接，可提高血清中的抗体水平，在防治感染消化道致病菌时，口服的效果则最好。
2.1 卵黄抗体防治水产动物细菌性疾病
在水产养殖过程中，水产动物易受到创伤弧菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、灿烂弧菌、溶藻弧菌等细菌的侵害，从而引发细菌性疾病。Qin 等研究结果显示，抗嗜水气单胞菌卵黄抗体可预防团头鲂感染嗜水气单胞菌，同时在治疗性试验中也有较好的效果；Xu 等在大菱鲆的饲料中添加微囊化的抗迟缓爱德华氏菌卵黄抗体，可预防大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌；海参腐皮综合征是养殖海参过程中常见且严重的疾病，发病初期常以细菌感染为主，且其病原菌还具有多样性和地域性。Xu 等研究结果显示，对海参腹腔注射黄海希瓦氏菌AP629 后，通过注射和喂食特异性卵黄抗体都能够显著降低其死亡率。关于卵黄抗体防治水产动物细菌性疾病的研究报道，见表1。
表1 卵黄抗体在水产动物细菌性疾病中的应用（部分）
续表
2.2 卵黄抗体防治水产动物病毒性疾病
异育银鲫易受到鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）的感染，爆发鳃出血病，造成大量死亡。寇海燕等为防治异育银鲫的鳃出血病，利用原核表达系统产生具有免疫原性的重组CyHV-2-ORF72 衣壳蛋白，将其作为抗原免疫蛋鸡，后获得具有高效价抗体的鸡蛋，并采用微包膜和冻干技术将免疫蛋制成全蛋粉。对已发病的异育银鲫投喂添加抗CyHV-2-ORF72 的免疫全蛋粉的饲料，发现添加抗CyHV-2-ORF72 的免疫全蛋粉的试验组异育银鲫的成活率显著高于未添加的对照组。病毒性神经坏死病（VNN），也称病毒性脑病和视网膜病，其主要传染病原是神经坏死病毒。该病在全球多种海水和淡水鱼类流行，且在鱼苗期的致死率可达100%，被认为是最严重的病毒性疾病之一。伊丽竹克隆并表达赤点石斑神经坏死病毒（RGNNV）的重组衣壳蛋白，并将其作为抗原免疫蛋鸡制备抗RGNNV 特异性卵黄抗体，后将卵黄抗体-病毒混合液感染石斑鱼鳍条细胞（GF-1），经Western blot 分析后发现，特异性抗RGNNV 的卵黄抗体可抑制病毒在GF-1 细胞中的复制，保护GF-1 细胞免受病毒感染。白斑综合征病毒（WSSV）感染养殖虾会出现高死亡率，其是由VP28、VP19 和VP15 基因编码主要致病蛋白。Lu等利用基因重组技术将 VP28、VP19 和 VP15 串联表达制成DNA 疫苗，用其免疫蛋鸡获得特异性卵黄抗体，另外还以灭活的WSSV 作为抗原免疫蛋鸡获得特异性卵黄抗体。结果显示，用灭活WSSV或DNA 疫苗免疫产生的特异性卵黄抗体处理的试验组其存活率分别为73.3%和33.3%，阳性对照组则在7 d 内全部死亡。卢亚楠进一步探究了抗WSSV 特异性卵黄抗体的被动免疫保护效果，研究结果显示，注射、口服和浸泡3 种给药方式均对免疫动物产生保护，此外，DNA 疫苗卵黄抗体的保护效果较灭活疫苗卵黄抗体的保护效果差。综上研究均显示，卵黄抗体对防治水产动物病毒性疾病有较好的效果。
3 结语
卵黄抗体作为一种绿色有效的抗生素替代品，在水产养殖病害防治中有着良好的应用前景，但实际应用过程中仍存在较多问题。首先大多数试验都证明卵黄抗体对革兰氏阴性菌有效，但对革兰氏阳性菌抑制效果的报道较少，这使得卵黄抗体的使用范围受到限制；其次，制备高质量的卵黄抗体的成本要远高于使用常规抗生素的成本，因此需要找到一种既能降低生产成本又能提高卵黄抗体质量的方法；再次，对于卵黄抗体的商品化生产，没有规范的操作过程和统一的质量标准。今后随着对卵黄抗体研究的逐渐深入，将上述问题解决后，卵黄抗体有望得到广泛应用。
