雷公藤甲素抑制类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞的炎症和迁移：基于circRNA 0003353/JAK2/STAT3信号通路

类风湿关节炎（RA）是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症、关节进行性破坏为特征，影响患者生活质量。成纤维样滑膜细胞（FLS）的增殖过度、凋亡不足、炎性细胞的大量浸润，是导致RA 患者关节畸形、功能障碍重要因素之一。JAK2/STAT3是多种细胞生长、活化、分化、凋亡及其功能发挥过程中重要的信号转导通路。研究发现JAK2/STAT3信号通路的异常活化可导致RA患者体内免疫炎症反应升高，影响关节腔血管生成等。circRNAs是一类新型的RNA，在FLS迁移、分子信号通路、免疫炎症反应等方面具有调控作用。本团队前期通过高通量测序及GO 分析研究，认为circRNA 0003353是参与RA炎症反应的关键circRNA。

本院RA住院患者多为疾病活动期，主要临床表现为关节肿痛而热、屈伸不利，发热、口渴、不欲饮、烦闷不安、小便黄等。雷公藤甲素（TPL）是环氧化二萜内脂化合物，大多从雷公藤属植物中提取而来，活性高，研究表明TPL能降低滑膜组织血管内皮生长因子、白细胞介素（IL-6）的表达水平。但是RA患者体内circRNA 0003353表达如何、炎症指标表达如何，以及TPL能否通过circRNA 0003353/JAK2/STAT3 改善RA-FLS 的炎症及细胞迁移尚不明确。

本研究首先临床观察RA 患者体内circRNA 0003353 及免疫炎症指标变化，再体外细胞培养，将circRNA 0003353过表达质粒转染至RA-FLS细胞中，以最佳浓度TPL干预，观察过表达circRNA 0003353状态下，TPL对RA-FLS中JAK2/STAT3信号通路、细胞因子和细胞迁移的影响，从而推测TPL 能否通过circRNA 0003353/JAK2/STAT3影响RA炎症反应和细胞迁移，为TPL治疗RA临床应用提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 基本资料

收集安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院RA患者（2021年3月～2021年9月）50例，30例正常人来自我院健康体检中心。其中男性5例，女性45例，年龄57.32±10.85岁；30例正常人来自我院健康体检中心，其中男性3例，女性27例，年龄53.28±16.03岁，两组基本情况一致，差异无统计学意义。用肝素钠抗凝管清晨空腹留取静脉血4 mL，利用Ficoll提取PBMCs，保存至-80 ℃冰箱备用。本研究通过安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会审查（伦理编号：2019AH-12）。

研究会以为国民经济建设和经济体制改革服务为目标，面向社会经济系统工程问题，组织自然科学、工程技术工作者和哲学、社会科学工作者一道，创新和运用定量与定性相结合、人脑与电脑相结合等系统工程理论、方法，形成了一批科研成果，为推动政府、部门与企业决策的民主化、科学化、制度化提供智力支持，为科学决策贡献了力量。

1.2 诊断及纳入、排除标准

保管马铃薯要做好防病、防冻、防腐等项工作。做好田间的防病工作，及时拔除病株，喷洒药剂，防止病害蔓延。种用马铃薯可适当提早收获，食用马铃薯不宜收获过早，在大部分茎叶由黄绿变为枯萎、薯块发硬时开始收获，并抓紧在霜冻前收完。收获后，在阴凉通风处保管几天，再装入地窖长期保管。装窖时拣出损伤、虫咬或感染病害的薯块。装窖前禁止日晒，防止毒素增加。装薯前一周打扫地窖，敞开窖盖，晒窖和散发窖内湿气。马铃薯装窖时，不能装满。

教师要扮演好自己的角色，努力成为合格的学习督促者，教学改革的创新者。随着社会的不断进步和发展，教育的改革力度不断加大，对于教师的要求也越来越高。但是教学的环境过于封闭，教师没有更多的机会和外界进行过多的接触，所以教师的人生视野往往很容易被局限，慢慢的和学生之间的心理差距也越来越大。这种差距的出现，往往会使学生与教师在学习过程中很难产生共鸣，不利于教学质量的提升。教师要敢于从实际生活中累积教学素材，多借鉴优秀教师的教学经验，在空闲时间教师也可以参加继续教育等，只有不断学习才能够提升自身的个人素质能力，拓宽个人的知识内涵，为提升课堂教学有效性做好基础的保障。

1.3 FLS的培养与转染

1.5.3 Western blot检测p-JAK2，p-STAT3，JAK2，STAT3蛋白的表达 收集细胞样本，加入RIPA 裂解液1 mL（内含1 mmol/L PMSF）进行裂解。离心10 min，收集上清液，在收集的蛋白样品中按照1∶4 加入5×SDSPAGE蛋白上样缓冲液。上样，电泳，转膜后，把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗，封闭。滴加p-JAK2（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、STAT3（1∶1000）一抗，4 ℃缓慢摇动孵育过夜；洗涤后，滴加1∶20 000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1.5 h。漂洗后用ECL发光试剂盒来检测蛋白。

1.4 药物、试剂与仪器

以上的模型只是总模型，该模型需要根据口译的特点进行修改。从模型本身所引出的研究问题有：什么因素能够促成学生的涌流体验？学生在的涌流体验是怎么样的？涌流体验带来怎样的学习表现？通过研究这些问题，旨在提升学生在学习口译时的体验，培养学生对口译的兴趣。

选定地块后，应考虑土壤生态环境对黄芩生长的影响，张向东等研究发现，随着土壤紧实度增大，黄芩根系活力降低，加速植株衰老[25]；土壤中有重金属元素累积时，黄芩中重金属含量与土壤中重金属含量成正比[26]。黄芩连作障碍来自于生长年限延长，土壤中真菌含量随之增加，且根际真菌增长幅度显著高于非根基区域[27]，提高根腐病发病几率[6]。

1.5.4 CCK-8检测RA-FLS的细胞活力 将细胞接种到96孔板中并培养24 h。然后在指定的时间点（第24、48、72 h）将CCK-8（10µL）装载到每个孔上，然后在37 ℃下再次培养4 h。使用微孔板读取器（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量值。根据值绘制细胞活力曲线。本实验独立重复3次。

Western blot结果显示3个不同序列HPV16 E6 shRNA质粒转染后PRDM5表达上调见图3。应用Realtime-PCR检测3个不同序列HPV16 E6 shRNA质粒转染后HPV16 E6的表达水平，经3次重复试验后，发现第3个HPV16 E6 shRNA3干扰HPV16 E6的表达比较稳定，将这一质粒留用进行后续实验。

荧光显微镜（Motic，BA410E）；普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司，K960）；荧光定量PCR 仪（Thermo Scientific，PIKOREAL 96）；高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-3021HR）；酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司，RT-6000）。

1.5 检测指标

1.5.1 RT-qPCR 检测circRNA 0003353 的表达 Trizol提取各组RA-FLS总RNA，逆转录反应，进行扩增反应，琼脂糖凝胶电泳，采用Gelpro32 凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析，以β-actin表达量为参照采用2进行相对定量分析。

1.5.2 ELISA检测细胞因子IL-4、IL-6、IL-17 收集各组RA-FLS培养上清液，1000 r/min离心10 min，弃去沉淀。将上清液加入酶标板中（100 μL/孔），37 ℃孵育1.5 h，采用ELISA方法，严格按照各试剂盒说明书进行操作。

RA原代成纤维样滑膜细胞经SV40过表达慢病毒转染而成的永生化细胞系。在青霉素（终浓度为100 U/mL）和链霉素（终质量浓度为0.1 mg/mL）的RPMI 1640培养基，5%CO、37 ℃的细胞培养箱中培养，待细胞融合度达70%即可传代。根据制造商的说明，将pcDNA3.1-circRNA 0003353与其阴性对照用Li-pofectamine2000转染至RA-FLS中，继续孵育24 h。pcDNA3.1-circRNA 0003353与其阴性对照由上海GenePharma公司合成。

诊断标准：所有患者均采用2010年美国风湿病学会（ACR）联合欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的RA诊断标准；纳入标准：符合上述诊断；均签署知情同意书；一般资料齐全；排除标准：关节完全丧失功能者；合并有其他器官功能病变或免疫性疾病；妊娠或哺乳期妇女；观察期间应用免疫抑制剂和生物制剂者。

DMEM 培养基（Hyclone）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；逆转录试剂盒（TaKaRa）；Fluoromount-G 荧光封片剂（SourthernBiotech）；Human IL-4/IL-6/IL-17 ELISA试剂盒（RX106128H/RX106126H/RX106160H，泉州市睿信生物科技有限公司）；JAK2/p-JAK2/STAT3/p-STAT3（ab39636/ab32101/ab68153/ab32143,Abcam）。

RT-qPCR实验结果显示，与TNF-α组相比，TPL组RA-FLS 中circRNA 0003353 表达降低（＜0.05）；与TPL 组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353 组RA-FLS中circRNA 0003353表达升高（＜0.05），可逆转TPL对RA-FLS作用（图7）。

1.6 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，两组之间比较，符合正态性和方差齐性，则采用两独立样本检验，反之，则采用秩和检验，多组数据比较采用one-way ANOVA检验。相关性分析中，符合正态性的连续变量数据采用Pearson分析，反之，则采用Spearman分析。＜0.05时认为差异具有统计学意义。

TPL试剂购自上海源叶生物技术有限公司（编号B20709）。本团队前期用CCK-8检测来评估不同浓度TPL处理RA-FLS活力，结果显示，当TPL浓度为10 ng/mL干预后，RA-FLS细胞活力降低至50%左右。因此，本文研究采用10 ng/mLTPL作为最佳浓度进行实验。

2 结果

2.1 circRNA0003353在RA患者PBMCs中的表达升高

RT-qPCR结果显示，与正常对照组相比，circRNA 0003353在RA患者PBMCs中表达升高（＜0.05）；ROC曲线结果显示，circRNA 0003353 可以作为协助诊断RA 的分子标志物（AUC=90.5%，＜0.001，95%:0.83-0.98）（图1）。

2.2 circRNA 0003353与RA湿热痹阻证患者炎症指标的相关性分析

Pearson相关性分析结果显示，RA湿热痹阻证患者circRNA 0003353 与ESR、RF、DAS28 呈正相关（＜0.05，图2）。

2.3 TPL降低RA-FLS中circRNA0003353表达

RT-qPCR实验结果显示，在0、24、48、72 h，最佳浓度TPL降低RA-FLS中circRNA 0003353表达，且呈时间依赖性（＜0.05，图3）。

2.4 TPL抑制RA-FLS细胞活力和细胞迁移能力

CCK-8 法检测最佳浓度10 ng/mL TPL 处理RAFLS 24、48、72 h的活力。结果显示，在24、48、72 h内，TPL抑制RA-FLS的细胞活力（＜0.05），且呈时间依赖性；在48 h时，RA-FLS细胞活力为0.547，最接近50%（图4A）。因此，选择48 h为最佳作用时间进行进一步的研究。Transwell迁移实验结果表明，经TNF-α刺激后，在24、48、72 h，RA-FLS 的细胞迁移数量增多，而TPL可以抑制RA-FLS的细胞迁移（＜0.05，图4B、C）。

2.5 TPL升高RA-FLS抑炎细胞因子IL-4，降低促炎细胞因子IL-6、IL-17

ELISA 实验结果表明，在0、24、48、72 h，最佳浓度TPL升高RA-FLS抑炎细胞因子IL-4（0.05），降低促炎细胞因子IL-6、IL-17，且呈时间依赖性（＜0.05，图5）。

2.6 TPL降低RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达

Western blot 实验结果显示，经TNF-α刺激，RAFLS 中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达升高（＜0.01），JAK2、STAT3 总蛋白表达无显著变化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（＜0.05）；最佳浓度TPL可降低TNF-α刺激后RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达（0.01），JAK2、STAT3总蛋白表达无显著变化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（＜0.05，图6）。

2.7 转染circRNA 0003353质粒后，TPL降低RA-FLS中circRNA0003353表达

1.5.5 Transwell 实验检测RA-FLS 细胞迁移 将RAFLS细胞消化后，洗涤、重悬调整细胞密度至2×10/mL，取细胞悬液200µL至Transwell小室中，下室加趋化因子培养24 h，多聚甲醛固定、PBS洗涤后，加0.5%结晶紫染色20 min，擦去未迁移细胞。使用微孔板读取器（Bio-Rad，Hercules,CA,USA）测量值。根据值绘制图表。本实验独立重复3次。

2.8 TPL通过circRNA 0003353抑制RA-FLS细胞活力和迁移能力

将circRNA 0003353 过表达质粒转染至RA-FLS中，CCK-8实验结果显示TPL可抑制RA-FLS细胞活力（＜0.05）；与TPL组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353组RA-FLS细胞活力升高（＜0.05），可逆转TPL对RAFLS作用（图8A）。Transwell迁移实验结果表明，TPL可抑制RA-FLS细胞迁移能力（＜0.05）；与TPL组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353组RA-FLS细胞迁移能力升高（＜0.05），可逆转TPL对RA-FLS作用（图8B、C）。

2.9 TPL通过circRNA 0003353升高RA-FLS抑炎细胞因子IL-4，降低促炎细胞因子IL-6、IL-17

ELISA实验结果显示，与TNF-α组相比，TPL组RAFLS中IL-4升高（＜0.05），IL-6、IL-17降低（＜0.05）；与TPL 组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353 组RA-FLS中IL-4降低（＜0.05），IL-6、IL-17升高（＜0.05），可逆转TPL对RA-FLS作用（图9）。

英国肉用家畜委员会下属有25%以上的猪场应用液体饲料饲喂。英国Wheyfeed有限公司每年向整个英国销售运输超过20万吨液体副产品。荷兰小麦淀粉、土豆皮、乳清粉和酵母浓缩蛋白质等高水分副产品年产量约575万吨，不宜远距离运输，主要用在猪饲料上。荷兰约60%的规模化猪场使用液体饲喂技术[2]。随着乙醇工业的发展，加拿大安大略省约有20%的生长育肥猪饲喂含玉米酒糟和浓缩浸出水溶物配制的液体饲料[3]。

2.10 TPL 通 过circRNA 0003353 降 低RA-FLS 中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达

Western blot实验结果显示，与TNF-α组相比，TPL组RA-FLS 中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达升高（＜0.05），JAK2、STAT3总蛋白表达无显著变化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（＜0.05）；与TPL 组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353 组RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达升高（＜0.05），JAK2、STAT3 总蛋白表达无显著变化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（＜0.05，图10）。

轩辕明摆摆手，“谁说我们要自己带啦？你们别忘了，每到一列山系的尽头，我们都要用祭祀山神的方式和校长互相传递信物啊！”

3 讨论

RA患者主要以关节和周围组织炎症病变为主，骨质破坏，甚至关节畸形的免疫性疾病，其中RA-FLS异常增殖、迁移、侵袭和炎症反应在RA进展中起着关键作用。中药材雷公藤具有祛风除湿、消肿止痛等功效，可以有效缓解关节肿胀、晨僵等。其中TPL是从雷公藤中最主要的活性物质，可以通过抑制炎症信号通路，改善滑膜炎症环境，调节骨代谢。本团队前期研究发现circRNA 0003353与RA炎症反应相关，但目前国内外对circRNA 0003353临床研究较少，其与炎症指标是否存在调控作用及与TPL之间的影响尚未可知，故本文选择circRNA 0003353、JAK2/STAT3组合，从炎症和细胞迁移角度研究TPL对RA治疗作用。

本文通过RT-qPCR 检测发现RA-PBMCs 中circRNA 0003353 表达上调，且与炎症指标ESR、RF、DAS28呈正相关。研究发现lncRNA MK5-AS1在RA中表达上调，且与ESR、CRP、RF、anti-CCP呈正相关。circRNA 0088194在RA-FLS中表达上调，并与DAS28相关，这与本研究结果类似，lncRNAs和circRNAs同为非编码RNA，都参与了RA发生发展，在RA患者中异常表达，且与炎症指标显著相关，此外，本文还通过ROC 曲线计算得到AUC=90.53%，表明circRNA 0003353是RA的危险因素，可以作为协助诊断RA的分子标志物。故circRNA 0003353 可能通过调控ESR、RF、DAS28等炎症指标参与RA发病，本团队前期研究发现TPL可以通过非编码RNA干预RA-FLS，故本研究接下来在细胞实验中，通过构建circRNA0003353过表达质粒转染至RA-FLS中，探究其机制变化及TPL干预作用。

细胞实验结果表明TPL 呈时间依赖性抑制RAFLS中circRNA0003353表达、升高抑炎细胞因子IL-4，降低促炎细胞因子IL-6、IL-17和细胞活力和迁移能力，研究表明TPL通过下调lncRNA ENST00000619282促进RA-FLS的炎症反应和细胞凋亡。TPL对辅助T细胞增殖及其相关细胞因子具有抑制作用。这与本研究结果相同，TPL都可降低非编码RNA的表达，且抑制FLS的炎症反应。且FLS细胞增殖、迁移能力与RA患者关节肿胀、形变相关，TPL可以抑制RA-FLS的迁移，促进细胞凋亡。此外挽救实验中转染circRNA0003353过表达质粒后，circRNA0003353可以逆转TPL对免疫炎症、细胞活力、迁移的抑制作用。JAK2/STAT3是多种细胞因子转导的重要信号通路，参与RA炎症反应、增殖和凋亡。本研究通过检测p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达发现TPL 可通过circRNA 0003353 抑制p-JAK2、p-STAT3 表达，降低p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值。研究表明TPL通过lncRNARP11-83J16.1介导URI1和β-catenin 信号通路，降低RA-FLS 增殖、侵袭和炎症。TPL可以通过JAK2/STAT3信号通路抑制炎性细胞因子表达和FLS细胞增殖，这与本研究结果类似，TPL可以通过抑制非编码RNA抑制炎症信号通路，从而抑制炎症反应。URI1和β-catenin与JAK2/STAT3信号通路都是RA经典炎症信号通路，可以影响RA疾病发展。

综上所述，circRNA 0003353在RA患者中表达上调，与炎症指标存在相关性，TPL可通过调控circRNA 0003353，干预JAK2/STAT3信号通路，抑制RA-FLS炎症反应和细胞迁移，发挥治疗RA作用。接下来我们将通过动物实验进一步研究TPL在RA模型大鼠中是否存在对非编码RNA和下游靶基因的调控作用。