甘珀酸增强RSL3对耐顺铂睾丸癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用

睾丸癌是20～34岁男性最常见的实体肿瘤，且近几十年来全球发病率稳步上升。顺铂是临床上广泛使用治疗睾丸癌的一线化疗药物，虽然睾丸癌患者对以顺铂为基础的治疗效果好，但仍有一小部分年轻男性由于内在的或获得性耐药表现出对传统的治疗方式无效，最终死于进展性疾病。因此，寻找新的药物或靶点提升睾丸癌患者治愈率具有重要研究意义。

铁死亡是一类以铁依赖的、脂质过氧化物积累为特征的死亡形式。RAS选择性致死化合物3（RSL3）是常用的铁死亡诱导剂之一，其作用机制是通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）造成细胞脂质过氧化物堆积而导致铁死亡的发生。研究表明，铁死亡诱导剂在多种癌症类型的模型中显示出很好的抗肿瘤活性，包括非小细胞肺癌、结直肠癌、胶质瘤细胞。急性白血病MOLM13耐药细胞株较非耐药细胞株对RSL3 的抑制作用更加敏感，更容易被诱导发生铁死亡。铁死亡诱导剂对肿瘤细胞铁死亡的诱导，为肿瘤治疗提供了新的思路。然而，铁死亡诱导剂RSL3对耐顺铂睾丸癌的作用尚不明确。

甘珀酸（CBX）是一种半合成药物，源自天然三萜化合物甘草次酸，能够诱导多种癌细胞凋亡和生长抑制，并且甘珀酸可以提高神经母细胞瘤对依托泊苷和阿霉素的敏感性。本课题组前期研究发现，甘珀酸可以影响睾丸癌敏感株I-10对顺铂的敏感性。然而甘珀酸是否可以影响睾丸癌耐药株I-10/DDP对RSL3的敏感性尚未有相关研究。为此，本文旨在研究RSL3是否可以诱导耐药睾丸癌细胞（I-10/DDP）发生铁死亡以及是否影响耐顺铂睾丸癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，并探讨甘珀酸对RSL3抗耐药睾丸癌活性的影响及其作用机制，为铁死亡诱导剂在睾丸癌治疗中的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株与细胞培养

耐顺铂睾丸癌细胞株（I-10/DDP）采用浓度递增法诱导耐药，后续通过检测耐药指数（RI=耐药细胞系IC/亲本细胞系IC）＞3确定其耐药性。细胞在含5%CO的细胞培养箱中培养。

1.2 主要试剂

RPMI 1640 培养基（Biosharp）；顺铂（DDP）（Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；RSL3、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、甘珀酸（Sigma-Aldrich）；GSH 试剂盒（南京建成）；GPX4 抗体（Abcam）；C11 BODIPY 581/591 荧光探针（赛默飞）；FerroOrange荧光探针（DOjindo）；GAPDH（Proteintech）；胰酶、细胞裂解液（上海碧云天）；其他常用试剂均为国产分析级。

1.3 细胞活力测定-MTT

在Transwell 上室内加入50µL 基质胶，置于37 ℃恒温箱中孵育30 min，待胶凝固。收集I-10/DDP细胞，用无血清RPMI 1640培养基调整为含药的细胞悬液（2×10/mL），药物分组为：Control组、甘珀酸（100 μmol/L）组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸合用RSL3 组；分别取100µL加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培养液600µL。每组设置2个复孔，实验重复3次；培养48 h后取出Transwell 小室；用4%多聚甲醛室温固定30 min，结晶紫室温染色30 min。采用光学倒置显微镜（×200）下计数侵袭至微孔膜下层的细胞，每个样本观察5个视野。

1.4 集落克隆实验

无需在Transwell上室内铺基质胶，其余步骤同1.6。

使用SPSS 20.0进行统计分析，数据表示为均数±标准差，两组之间均数比较采用两样检验，两组以上均数比较采用单因素方差分析。统计图采用Graphpad Prism 5.0 绘制，＜0.05为差异具有统计学意义。

1.5 划痕实验

将细胞以2×10/孔铺种于6孔板，待细胞生长至80%汇合时，用200 μL 枪头沿孔板中央划一条直线，用PBS 清洗去除漂浮细胞，每孔加入2 mL 含药无血清培养基继续培养，药物分组为：Control 组、甘珀酸（100 μmol/L）组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸合用RSL3组；分别在培养0 h、24 h用显微镜拍照。划痕愈合率=（0～24 h的划痕宽度/0 h的划痕宽度）×100%。

例如，于干燥、低温或者风沙较大的环境下，没牛羊患疥癣类寄生虫病的可能性会大幅度提升，这时由于此类气候环境有利于疥癣病原体的生长和传播，牛羊在感染此类寄生虫以后，会出现全身奇痒、皮肤变厚且逐渐粗糙化、机体消瘦及脱毛情况严重等症状。同时，此类寄生虫会长时间的存在于牛羊的体外表层，吸取牛羊机体的营养，致使患病机体日益虚弱化，最终因免疫力极具降低而死亡。想要提升牛羊寄生虫病的预防及控制质量，我们需要注重对影响各种牛羊寄生虫的生长及繁殖条件的因素及其与寄主间存在的关系加以充分的了解和分析，同时，也需要对寄生虫的生长及传播条件等进行有效掌握和科学控制。

1.6 Transwell侵袭实验

取对数生长期细胞（I-10/DDP），以5×10cells/mL密度接种于96孔板，待细胞长至约60%后，更换含药培养液；对于甘珀酸与RSL3的联合实验，实验分为单用RSL3组和甘珀酸合用组，RSL3浓度分别为0、1、2、4、8、16、32 μmol/L，甘珀酸浓度为100 μmol/L；对于铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）联合RSL3以及甘珀酸合用RSL3实验，实验分为：Control组、Fer-1（2 μmol/L）组、RSL3（4 μmol/L）组、RSL3+Fer-1组、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组、甘珀酸+RSL3+Fer-1组继续培养24 h后，添加5 mg/mL MTT溶液（10µl/孔），在37 ℃的黑暗条件下孵育4 h。弃去培养液后每孔加入100 μL DMSO置于37 ℃烘箱中孵育30 min，酶标仪检测值。样品检测全程避光操作。根据公式计算细胞存活率。

刘培峰:在提倡传统工艺振兴时,实用性是一个根本性的问题。民艺学家张道一指出,实用性是“造鸡蛋”,然后才有艺术性,即“画鸡蛋”;日本民艺理论家柳宗悦也认为,“为实用服务,才是工艺之根本”。在当前保护和振兴传统工艺的过程中,应如何认识实用性?

1.7 Transwell迁移实验

将细胞以1500个/孔接种于六孔板，待细胞紧贴壁以后，用含药培养液培养9 d，药物分组为：Control组、甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸合用RSL3组；显微镜下观察集落数大于50，弃培养液，用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min后，再用0.1%结晶紫染色30 min，并拍照。

黄岑苷为黄岑茎叶黄酮的主要药理成分，具有消炎、调节免疫功能的作用［9-10］，其对感染CVB3病毒的Hela细胞具有保护作用［11］。黄岑可通过抑制免疫细胞活性，降低机体内炎症因子水平，进而缓解患者炎症反应发展［12］。本研究结果显示通过给予黄岑茎叶黄酮干预后，小鼠心功能得到缓解，心肌细胞炎性浸润以及间质纤维化比例均降低，说明黄岑茎叶黄酮能够一定程度上缓解VM小鼠心功能以及炎症反应，且高剂量作用效果与利巴韦林效果相似，提示黄岑茎叶黄酮可能为治疗VM的新型药物。

1.8 FerroOrange荧光探针—检测细胞内Fe2+水平

取对数生长期细胞以1×10/mL的密度接种于12孔板中，培养至细胞密度为60%左右，药物处理24 h，药物分组为：Control 组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组；将旧培养液倒掉，用不含血清的培养液清洗细胞2次，再加入用无血清培养液配制的1 μmol/L的FerroOrange荧光探针工作液，避光的条件下在37 ℃细胞培养箱中孵育30 min。将12孔板转移到活细胞工作站下观察细胞荧光强度，并每组随机选择视野进行拍照。

1.9 Lipid ROS检测

将细胞以2×10/mL的密度接种于六孔板，待细胞长至60%左右，药物处理24 h后，药物分组为：Control组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组；加入浓度为5 μmol/L的C11 BODIPY 581/591荧光探针避光染色。在37 ℃细胞培养箱中孵育30 min后，用无EDTA的胰酶消化细胞并收集至10 mL离心管中，1200 r/min离心8 min，再用PBS离心清洗2次。在细胞沉淀中加入300 μL PBS让细胞重悬，转移至流式管中在激发光为488 nm检测氧化态细胞数量，收集数据并保存文件，使用Flowjo进行数据分析。

MTT法检测发现甘珀酸浓度为100 μmol/L时对细胞存活率无影响，RSL3呈浓度依赖性降低细胞存活率，且在RSL3浓度2、4、8 μmol/L 时，甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组的细胞存活率明显低于单用RSL3组（＜0.05 图1A）。根据MTT结果，为了保证进行侵袭、迁移实验时细胞存活率90%以上，实验中选用低浓度RSL3（2 μmol/L），后续实验包括集落以及铁死亡相关指标检测也是选用RSL3（2 μmol/L）。在甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或甘珀酸合用RSL3处理后，集落克隆实验检测发现单用RSL3 组集落形成数明显低于Control组；与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组集落形成数显著进一步下降（图1B）。

1.10 Western blot检测

I-10/DDP 细胞在甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或甘珀酸合用RSL3 处理后，划痕实验和Transwell迁移实验发现，与Control组相比，RSL3组划痕愈合率减小、穿膜细胞数减少（=0.012，图2A；＜0.001，图2B）；与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组划痕愈合率进一步减小、穿膜细胞数进一步减少（=0.005，图2A；=0.001，图2B）。Transwell侵袭实验发现，与Control 组相比，RSL3 组穿膜细胞数减少（＜0.001，图2C）；与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组穿膜细胞数进一步减少（=0.002，图2C）。

1.11 统计学分析

另外，在特殊技能一栏后面，乔布斯做了专门的解释：“来自惠普附近的海湾地区。”惠普，全球著名的电子信息科技公司。乔布斯这是在告诉看简历的人：他每天和惠普的员工生活在一起，他随意交谈的某个人可能就是惠普的某位重要工程师，他的周围充满的是电子科技信息，耳濡目染，他熟悉这个行业，他在这方面一定有独特的洞察力，因此值得录用。“里德学院”和“来自惠普附近的海湾地区”，似乎都是简短而普通的信息，但被乔布斯这样写在简历里，就成了他独一无二的优势和资源。善于挖掘自己的优势资源，哪怕只是一个住址，这应该是乔布斯这份简历最大的亮点。

2 结果

2.1 甘珀酸增强RSL3抑制I-10/DDP细胞生长增殖的作用

不仅如此，科莱恩十分重视可持续发展。公司将所有的产品按照可持续发展的绩效性、社会性、环境性进行一个筛选。经过筛查，公司将不符合可持续发展理念的产品进行有计划的创新，或者寻求替代解决方案，使其获得可持续性，而把无法获得可持续性的产品进行淘汰。

2.2 甘珀酸增强RSL3抑制I-10/DDP细胞侵袭、迁移能力的作用

收集细胞，加适量增强型RIPA，冰上裂解1 h后，离心收集蛋白并定量。配制12%SDS-PAGE凝胶。将定量样品上样，电泳，转膜，封闭，一抗（GPX4）4 ℃孵育过夜，二抗（GAPDH）于室温孵育2 h，TPBS洗膜；ECT发光试剂盒暗室发光，显影；Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，Bio Imaging system（Gene Genius）扫描灰度值定量分析。

2.3 甘珀酸促进RSL3诱导I-10/DDP细胞的铁死亡

本实验选用较高浓度RSL3（4 μmol/L），MTT法观察发现铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）可以逆转RSL3（4 μmol/L）、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3对I-10/DDP 细胞的增殖抑制作用（=0.001,＜0.001，图3A）。I-10/DDP细胞经单用RSL3（2 μmol/L）、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3处理24 h后，Western blot检测出，与Control组相比，单用RSL3组GPX4的表达水平下降，而与单用RSL3 组相比，甘珀酸合用RSL3 组GPX4的表达水平明显下降（=0.001,=0.01，图3B）；C11 BODIPY 581/591荧光探针处理细胞后，使用流式细胞术检测发现，相比于Control组，单用RSL3组细胞中lipid ROS的表达水平增加，而与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3 组细胞中lipid ROS 水平明显增加（=0.001,=0.001，图3C）；FerroOrange荧光探针检测细胞内Fe水平，橙色荧光越强代表Fe水平越高，相比于Control 组，单用RSL3 组荧光强度增强，而与单用RSL3组相比，甘珀酸联合RSL3处理后细胞释放出更强的荧光（图3D）。

综上所述，在现当代教育模式的大背景下，小学语文教师要认清教学的困境，辅之以相应的解决办法，提高学生的语文学习能力，为他们未来的学习发展打下坚实的基础。

3 讨论

睾丸癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，20世纪70年代在临床治疗中引入了顺铂，使睾丸癌患者的生存率得到了提高，但目前仍然存在限制顺铂治疗的两个主要因素为药物引起的包括肾毒性、耳毒性和肝毒性在内的不良反应，以及肿瘤耐药性的发生。因此，探索新的治疗方案对睾丸癌患者至关重要。

铁死亡是新近发现的一种程序性死亡形式，与凋亡、坏死、自噬等死亡程序不同，典型的形态学表现为细胞容积皱缩、线粒体嵴减少等。最近的研究表明，激活铁死亡能有效地阻止肿瘤的进展，并能提高靶向治疗和化疗的疗效。然而，睾丸癌与铁死亡的关系尚不明了。深入研究铁死亡与睾丸癌之间的作用关系可能为治疗睾丸癌提供一种全新的思路。RSL3是铁死亡最常用的诱导剂之一，目前研究表明其可以在多种肿瘤中诱导铁死亡并抑制肿瘤细胞的生长，包括肾癌、结直肠癌、前列腺癌等。RSL3是否可以诱导耐药睾丸癌I-10/DDP细胞发生铁死亡以及是否可以抑制I-10/DDP细胞增殖、侵袭和迁移能力尚未有研究报道。我们采用RSL3处理I-10/DDP后，结果发现，细胞增殖能力、侵袭和迁移能力显著降低，这表明RSL3可以抑制睾丸癌耐药株I-10/DDP细胞活力。同时，为了验证RSL3致I-10/DDP细胞死亡的模式为铁死亡，我们将铁死亡抑制剂Fer-1与RSL3联用，观察RSL3对细胞的抑制作用是否能被逆转。Fer-1是一种铁死亡强效抑制剂，可以通过抑制脂质活性氧的生成而抑制铁死亡的发生。结果显示Fer-1能逆转RSL3降低细胞存活率的作用，证明RSL3诱导的细胞死亡模式为铁死亡。铁死亡的发生与Fe水平以及脂质活性氧的生成密不可分。细胞内游离的Fe在芬顿反应中与过氧化氢结合产生过多的羟基自由基和ROS，从而导致多不饱和脂肪酸被氧化，产生过多的脂质过氧化物从而导致铁死亡。GPX4是铁死亡的主要调节因子之一，其利用谷胱甘肽将有毒的脂质过氧化物转化为无毒的脂质醇，减少脂质过氧化物积累从而负性调控铁死亡。本实验在铁死亡指标中，与Control组相比，RSL3可使I-10/DDP细胞内GPX4表达下降、Lipid ROS和Fe水平升高，以上结果更进一步说明RSL3可以诱导I-10/DDP发生铁死亡。上述结果提示铁死亡诱导剂在睾丸癌患者的临床治疗上具有一定前景。

甘珀酸是一种盐皮质激素激动剂，它已被临床批准用于治疗食管溃疡。除了抗炎作用外，甘珀酸也存在抗肿瘤作用。甘珀酸通过抑制细胞凋亡抑制蛋白BIRC5/survivin，从而在K562 白血病细胞中引发细胞凋亡，并且可以增强TRAIL 诱导的人神经胶质瘤细胞凋亡。甘珀酸还可以提高神经母细胞瘤对依托泊苷和阿霉素的敏感性。而甘珀酸是否参与铁死亡进程以及是否也可以增加I-10/DDP细胞对RSL3敏感性尚未有研究。我们采用甘珀酸联合RSL3共同处理I-10/DDP细胞，结果显示，甘珀酸合用RSL3组与单用RSL3组相比，I-10/DDP细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显进一步下降，这表明甘珀酸可以增强RSL3的抗肿瘤活性。为了进一步探究甘珀酸是否是通过促进RSL3诱导的铁死亡从而增敏RSL3，本实验检测Fer-1 能逆转甘珀酸合用RSL3降低细胞存活率的作用；同时检测铁死亡相关指标，甘珀酸合用RSL3组与单用RSL3组相比，I-10/DDP细胞内GPX4蛋白表达水平降低、lipid ROS 水平升高、Fe水平升高，得出甘珀酸促进RSL3诱导的铁死亡。

综上所述，RSL3能够诱导耐药睾丸癌细胞发生铁死亡，并可以抑制耐顺铂睾丸癌细胞增殖、侵袭和迁移能力；甘珀酸通过促进RSL3诱导的铁死亡从而增强RSL3的抑制作用。单用RSL3或者合用甘珀酸可能是一种有前景的治疗睾丸癌策略。甘珀酸是否通过抑制Pannexins通道增加RSL3诱导的铁死亡水平，课题组后期将对此具体机制进行深入研究，从而为睾丸癌的临床治疗提供理论依据。