采用星点设计-响应面法优化姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶的处方和制备工艺

李佳佳, 宁偎锋, 李 磊

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院, 辽宁 沈阳 110142)

姜黄素[1-2][1,7-双-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5二酮]是从姜黄中提取的多酚化合物,具有抗氧化功能,被研究发现具有保护肝脏作用[3-4]、抗癌作用[5-6]、以及对神经退行性疾病和炎症性疾病的治疗作用[7].相关文献曾报道用质量分数为0.01%～0.25%姜黄素补充啮齿动物饮食,其通过抑制NF-κB、STAT3和MCP-1的过表达来保护微血管免受缺血再灌注损伤,进而达到治疗青光眼的目的[8].但姜黄素的水溶性差、生物利用度低,限制了其在临床中的应用.对于眼科疾病的治疗,大多数药物由于泪液稀释或者滴眼剂的流出并不能达到很好的疗效.局部给药是优选的给药途径,能减少全身吸收的副作用,可加快药物代谢和清除[9-11].本研究制得的空白凝胶基质,在常温下为液态,给药后立即在用药部位转化为半固态的凝胶,并结合姜黄素纳米混悬液制得一种姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶,为姜黄素在眼科方面的应用提供了一种思路.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

姜黄素 (天津市天新精细化工开发中心)、泊洛沙姆188 (P188,上海思域化工科技有限公司)、泊洛沙姆407 (P407,浙江玛雅试剂有限公司)、羧甲基壳聚糖(CMC,山东西亚化学科技有限公司)、戊二醛(GA,天津博迪化工股份有限公司)、去离子水(浙江杭州娃哈哈集团有限公司),均为分析纯.

AR1530精密电子天平,美国奥豪斯公司;DZF-6020型真空干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;RC-6型溶出度测试仪,天津市国铭医药设备有限公司;冰箱,山东澳柯玛股份有限公司;数控超声波清洗仪,上海必能信超声波有限公司;透析袋,南京森贝伽生物科技有限公司;恒温加热磁力搅拌器,巩义予华仪器有限责任公司.

1.2 姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶的制备

采用反溶剂法制备姜黄素纳米混悬液[12-14].取处方量的姜黄素溶于乙醇配置姜黄素乙醇溶液.按ω(乙烯醇)∶ω(姜黄素)=1.5∶1配置聚乙烯醇溶液.在350 r/min转速下,将姜黄素乙醇溶液注入聚乙烯醇溶液中,持续搅拌5 min,制得姜黄素纳米混悬液,暂存于4 ℃冰箱中.

采用搅拌子法制备空白凝胶基质.将一定量P407、P188和CMC溶于去离子水,放入55 ℃恒温加热磁力搅拌器中,向其中滴加一滴戊二醛,继续搅拌半小时.反应停止后在室温下冷却24 h,使用预先浸泡的纤维素膜(8000～14 000Mw.t)透析24 h,得到空白凝胶基质(如图1所示).

将姜黄素纳米混悬液从冰箱中取出,在高速磁力搅拌下缓慢加入空白凝胶基质,持续搅拌使其分散均匀,放入4 ℃冰箱冷却24 h以上,直至溶液澄清透明,得姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶.

图1 空白凝胶基质的制备流程

1.3 星点设计-响应面法优化设计

从4 ℃冰箱中取出空白凝胶基质,用模拟泪液稀释,轻摇振荡,放置至无气泡.测出泪液稀释前后的胶凝温度,t1为模拟泪液稀释前的相变温度,t2为模拟泪液稀释后的相变温度.

根据星点设计-响应面法,采用Design-expert 8软件,将单因素实验确定的P407与P188质量分数比、CMC体积分数、GA体积分数设置为自变量,t1、t2为响应指标,对检测结果进行多项回归、拟合方程、方差分析和失拟检验,生成二维高线图和三维响应面图.根据t1≥ 25 ℃和t2≤ 33 ℃,优化出两种最适制备处方,并对其预测值与实测值进行偏差分析.

1.4 结构表征

采用日本电子株式会社GSM-6701F型扫描电镜(SEM)对姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶进行形态测试,取真空干燥粉碎后的姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶,在其表面喷金,在20 kV加速电压下观察其表面形态;采用日本理学RigkuD/max-1200型X射线衍射仪(XRD)对姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶进行测试,扫描速度为1.2 (°)/min,扫描范围为5°～50°;采用天津港东FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)对样品进行测试,扫描范围为400 ～4000 cm-1;采用上海菁华科技仪器有限公司752型紫外可见分光光度计(UV-Vis)测定样品的吸光度.

1.5 性能测试

1.5.1 包封率和载药量测定

1.5.2 溶胀率测定

1.5.3 姜黄素体外释放率测定

称取适量的姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶、姜黄素纳米混悬液(含姜黄素5 mg)和5 mg姜黄素,分别放入透析袋中,将其置于100 mL模拟泪液中,然后全部放置于33 ℃恒温水浴槽中.从释放开始至第30、60、100、150、200、250、300及350 min时各取5 mL泪液,离心取1 mL上清液,用乙醇稀释至10 mL,测定其在427 nm处的吸光度.再补充5 mL相同模拟泪液至体系中,保持总体积不变.根据标准曲线计算不同释放时间药物溶出百分率,并对时间作图,绘制溶出曲线.载药水凝胶释药率计算公式为:释药率 =(释药质量/载药质量)×100%.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 泊洛沙姆比例对胶凝温度的影响

经过预实验,筛选出以P407与P188质量分数比为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1制得空白凝胶基质.其他实验参数为:戊二醛体积分数为2%、反应温度为55 ℃、搅拌速度为10 r/s、CMC体积分数为15%.图2(a)是P407与P188质量分数比对临界相变温度的影响曲线.由图2(a)可知P407与P188质量分数比对临界相变温度影响较大.因此,初步选定P407与P188质量分数比为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1来进行响应面优化.

2.1.2 姜黄素质量浓度对胶凝温度的影响

以P407与P188质量分数比为6∶1(即P407质量分数为18%,P188质量分数为3%)、CMC体积分数为15%、GA体积分数为2%、反应温度为55 ℃、搅拌速度为10 r/s制得空白凝胶基质.将空白凝胶基质与质量浓度为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L的姜黄素乙醇溶液混合制得姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶.图2(b)是姜黄素质量浓度对临界相变温度的影响曲线.由图2(b)可知姜黄素的质量浓度对胶凝状态未见显著影响.

2.1.3 戊二醛体积分数对胶凝温度的影响

选定P407与P188质量分数比为6∶1、搅拌速度为10 r/s、反应温度为55 ℃,分别加入体积分数为1%、2%、3%、4%、5%的戊二醛制备空白凝胶基质.图2(c)为戊二醛体积分数对临界相变温度的影响曲线.由图2(c)可知:随着戊二醛体积分数的增大,临界相变温度逐渐降低;当戊二醛体积分数为3%时,胶凝时间最适宜;当戊二醛体积分数过大,反应液会直接凝固并丧失温敏特性.

2.1.4 CMC体积分数对胶凝温度的影响

选定质量分数比为6∶1的P407和P188,向其中加入体积分数为10%、12%、14%、16%、18%、20%的CMC,在55 ℃时,转速为10 r/s,加入体积分数为3%的戊二醛制备空白凝胶基质.使用分度值为0.1的温度计测其临界相变温度.图2(d)是CMC体积分数对临界相变温度的影响曲线.由图2(d)可知胶凝的相变温度随CMC的体积分数增加而降低.

2.1.5 反应温度对胶凝温度的影响

选定质量分数比为6∶1的P407和P188,转速为10 r/s,分别在反应温度为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65℃时,向反应液中滴加体积分数为2%的戊二醛,测定制得的空白凝胶基质的临界相变温度.图2(e)是反应温度对临界相变温度的影响曲线.由图2(e)可知反应温度对临界相变温度并未产生显著影响.

图2 单因素对胶凝状态的影响

综合单因素实验结果发现姜黄素质量浓度和反应温度对临界相变温度的影响较小,即对胶凝状态影响较小;而P407与P188的质量分数比、CMC的体积分数和GA的体积分数对胶凝状态影响较显著,需要进一步进行处方工艺优化.

2.2 星点设计-响应面法优化分析

根据表1中的星点设计因素和水平进行姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶的制备工艺优化. Design-expert 8软件生成的多元线性回归及二项式拟合方程为:

t1=27.61-27A-1.55B-0.098C+1.19AB+0.13AC+0.32BC+0.86A1+1.05B1+0.56C1(R2=0.8732),

t2=31.17-2.65A-1.30B+0.076C-0.056AB-0.28AC+0.52BC+1.22A1+0.93B1+0.97C1(R2=0.9356).

其中:A为P407与P188的质量分数比;B为CMC的体积分数;C为GA的体积分数.可见拟合度较好.响应面模拟结果方差分析t1和t2的P<0.000 1.失拟项检验结果表明t2的结果也好于t1.

表2为星点设计及效应值,图3和图4分别为P407与P188质量分数比、CMC体积分数、GA体积分数对t1和t2三维响应面图.由表2、图3和图4可知:P407与P188的质量分数百分比和CMC的体积分数对临界相变温度影响较大;当P407与P188质量分数比和CMC体积分数取值较小时,图形平面性较明显,反应了取值较为恰当.

表1 星点设计因素和水平

表2 星点设计及效应值

图3 P407与P188质量分数比、CMC体积分数和GA体积分数对t1三维响应面图

由Design-expert 8软件进行优化,再结合二维等高线和三维响应面,选取了两个优化处方来制备此剂型,如表3所示.优化处方1∶P407与P188的质量分数比为7∶1,CMC体积分数为13.90%,GA体积分数为2%.优化处方2:P407与P188的质量分数比为5∶1,CMC体积分数为14.5%,GA体积分数3%.由表3中优化处方1和优化处方2的预测值与实测值偏差分析结果可知两处方偏差值均在±1%以内,符合眼部用药要求,即t1≥ 25 ℃、t2≤ 33 ℃.

图4 P407与P188质量分数比、CMC体积分数和GA体积分数对t2三维响应面图

表3 姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶优选处方

2.3 凝胶载药性能分析

对凝胶载药性能的研究是判断此剂型功能的重要标准之一.表4是两个优化处方制得的凝胶包封率和载药量比较,图5是两个优化处方制得的凝胶溶胀率比较.由表4可知:与优化处方1相比,处方2的包封率和载药量性能较好.由图5可知:随着P407与P188质量分数比增大,以及戊二醛体积分数减少,包封率和载药量越高,溶胀率越大.这可能与凝胶的三维孔洞有关,孔径越疏松,孔隙越多,药物更容易扩散,短时间内即可达到载药平衡.

表4 两个优化处方制得的凝胶包封率和载药量比较

图5 两个优化处方制得的凝胶溶胀率曲线

2.4 SEM分析

图6为姜黄素纳米混悬液和姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶的SEM照片(×60 000).

图6 样品SEM图

由图6可知:姜黄素纳米混悬液中粒子均呈球状,分布较均匀,且制备成姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶对纳米粒子形态无影响.

2.5 FT-IR分析

图7是羧甲基壳聚糖、泊洛沙姆和空白凝胶基质的红外测试曲线.由图7可知:羧甲基壳聚糖在 3200～3600 cm-1显示出非常强大的峰,这可能是—OH的拉伸振动和—NH的振动导致的.但是,在空白凝胶基质红外曲线中,此峰发生了变化,这可能与—NH2消失有关.1617 cm-1处左右的峰可能是由于—NH2的变形振动以及与—COO—基团的不对称拉伸振动重叠而产生的强峰,但产物中并未出现此峰.泊洛沙姆红外曲线中可能由于—CH拉伸、—CH2弯曲、面内—OH弯曲和—CO拉伸,分别在2889.73、1467.29、1343.46 cm-1处出现了特征峰,这些峰在空白凝胶基质中表现不明显或者消失不见.以上结果表明空白凝胶基质已成功合成.

图7 羧甲基壳聚糖、泊洛沙姆和空白凝胶基质的红外曲线

2.6 XRD分析

图8为羧甲基壳聚糖、泊洛沙姆、泊洛沙姆与CMC物理混合物和空白凝胶基质的XRD曲线.由图8可知:泊洛沙姆特征峰在20.03°和24.43°,羧甲基壳聚糖特征峰在21.30°.在泊洛沙姆与CMC物理混合物中,尽管峰很低,但也表现出两者峰的特征.所制得的空白凝胶基质XRD曲线中没有峰存在.

图8 XRD曲线

2.7 体外释放率

图9是姜黄素、姜黄素纳米混悬液和姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶随时间变化的体外释放率曲线.

图9 姜黄素、姜黄素纳米混悬液和姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶的体外释放率曲线

由图9可知:姜黄素在泪液中的释放非常缓慢,在200 min时,依据处方2制备的姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶的累积释放率为13.2%,姜黄素纳米混悬液的累积释放率为17%.与姜黄素纳米混悬剂相比,姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶可以达到缓释效果,且药物释放有明显的时滞现象.在释放初期,处方2的药物的释放率出现突释现象,这可能是大量的姜黄素吸附在水凝胶表面而不是包埋在凝胶的孔状结构中,药物未达到孔径的饱和程度所导致的.

3 结 论

本文制备了一种温敏性的姜黄素纳米水凝胶剂,并进行了体外性能测试,期望进一步拓展姜黄素在临床中的用途.首先,采用反溶剂法制得姜黄素纳米混悬剂,并将其载入以P407、P188与CMC交联所得的空白凝胶基质中,制备出姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶,并进行扫描电镜、红外光谱以及X射线衍射表征;然后,采用单因素法发现P407与P188的质量分数比值、GA体积分数以及CMC体积分数对此剂型的制备有显著影响;最后,对这3种影响因素进行星点设计-响应面法优化并进行体外释放性能的比较.结果显示:P407与P188的质量分数比为5∶1、CMC体积分数为14.5%、GA体积分数为3%时,姜黄素纳米混悬温敏性水凝胶具有缓释作用.本研究为该制剂的后续体内外研究奠定一定的基础,为姜黄素在眼科的临床应用提供了新思路.