秋水仙碱处理对鼓槌石斛原球茎多糖含量的影响

包英华 ，苏慧玲，陈永浩，冯艺飞，严基银，张自斌

（1.韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005； 2.广西壮族自治区农业科学院 花卉研究所，广西 南宁 530007）

鼓槌石斛（Dendrobiun chrysotoxumLindl.），又名金弓石斛、小爪黄草、粗黄草等，为兰科石斛属多年生附生草本植物，以新鲜或干燥茎入药，是《中华人民共和国药典》（2015年版）［1］收载的常用中药材. 鼓槌石斛分布于我国云南、广西、四川等省区［2］，主要含多糖、鼓槌菲、毛兰素和毛兰菲等活性成分，其中多糖是鼓槌石斛增强机体免疫功能和抗肿瘤的主要成分之一［3-6］.

由于鼓槌石斛市场需求量增大，野生资源已趋于濒危，远不能满足市场需求，为此目前进行鼓槌石斛人工培育或栽培研究，但存在生长周期长，存活率低，生产成本高以及优质种苗培育、炼苗和移栽技术尚未成熟等瓶颈问题［7-9］，很难达到预期目标. 这些情况说明，提高鼓槌石斛多糖的途径完全依靠野生或栽培药材是行不通的.经研究发现，石斛原球茎具有和原植株同样的物质代谢和形态发育潜能［10］，用原球茎合成多糖比细胞培养合成多糖产量更稳定，更容易实现规模化生产［11-13］.

目前，采用植物组织培养技术与诱导物相结合方法，提高珍稀濒危药用植物组织细胞代谢产物，已成为普遍关注的问题［14］. 尤其是秋水仙碱作为非生物诱导物，应用于多种药用植物的多倍体培育，已成功获得了形态（如茎秆、叶片、果实、种子、花朵等）加大和增多营养物质（如蛋白质、糖类、脂肪）的植物［15-17］. 控温处理与秋水仙碱结合使用，更能提高秋水仙碱的诱导作用［18-19］.

本文采用秋水仙碱与控温处理相结合的方法，对鼓槌石斛原球茎进行处理，探索秋水仙碱浓度、处理温度、处理时间和原球茎培养时间对鼓槌石斛原球茎多糖含量的影响，以期为获得高多糖含量的原球茎培育体系，以及为以原球茎为原料生产鼓槌石斛多糖提供依据.

1 材料与方法

鼓槌石斛采自于云南西双版纳，其种胚在1/2 MS基本培养基上培养60 d后，在无菌条件下，分别浸泡在不同浓度（0、0.1%、0.3%和0.5%）的秋水仙碱溶液中，分别在不同温度（0、4、8、26 ℃）下进行不同时间（12、24 h）的处理，随后把原球茎继代培养在1/2 MS基本培养基上，在温度为26±2 ℃，光照强度 1 500~2 000 Lx，光照时间14 h·d-1条件下进行培养，同时以不加秋水仙碱、26 ℃处理的为对照组（CK）.

每隔培养20 d后收取的鼓槌石斛原球茎除去培养基，以瓶为单位（3瓶为一组）称量并记录原球茎的鲜重；60 ℃烘干并称重，采用《中华人民共和国药典》（2015版）法测定鼓槌石斛原球茎多糖含量，实验数据用SPSS Statistics 25.0软件进行统计分析.

2 实验结果

2.1 不同浓度秋水仙碱在不同温度下处理12 h对鼓槌石斛原球茎多糖含量的影响

从表1可见，秋水仙碱浓度、处理温度和原球茎培养时间均对鼓槌石斛原球茎多糖含量均产生影响，而且各处理因素之间差异显著.

表1 秋水仙碱浓度、温度和培养时间对鼓槌石斛原球茎多糖含量的影响（处理时间：12 h）

原球茎培养时间为20 d时，对照组和秋水仙碱浓度为0.1%，温度均为8 ℃的原球茎多糖含量分别可达23.77%和35.60%；秋水仙碱浓度提高为0.3%（处理温度为0 ℃）和0.5%（处理温度为4 ℃）的多糖含量为19.01%和24.42%；分别高于其他温度处理的多糖含量.

原球茎培养时间为40 d时，对照组（处理温度为4 ℃）的多糖含量可达15.87%； 秋水仙碱浓度为0.1%和0.5%，处理温度均为0 ℃时，多糖含量分别为18.70%和12.85%；秋水仙碱浓度为0.3%（处理温度为8 ℃）的多糖含量为16.81%；分别高于其他温度处理的多糖含量.

原球茎培养时间为60 d时，对照组和秋水仙碱浓度为0.1%，处理温度均为8 ℃时，多糖含量分别可达20.77%和22.47%； 水仙碱浓度为0.3%和0.5%，处理温度均为0 ℃时多糖含量分别为25.31%和12.40%；分别高于其他温度处理的多糖含量.

原球茎培养时间为80 d时，对照组和秋水仙碱浓度为0.1%，处理温度均为8 ℃时，多糖含量为22.04%和16.26%； 秋水仙碱浓度为0.3%，处理温度均为8 ℃时的多糖含量为23.77%；秋水仙碱浓度为0.5%，处理温度均为26 ℃时的多糖含量为14.79%；分别高于其他温度处理的多糖含量.

分析结果表明，不同浓度秋水仙碱在不同温度条件下处理12 h对提高鼓槌石斛原球茎多糖含量的最佳处理组合为秋水仙碱浓度为0.1%、处理温度为8 ℃、原球茎培养时间为20 d，多糖含量可达35.60%.

2.2 不同浓度秋水仙碱在不同温度下处理24 h对鼓槌石斛原球茎多糖含量的影响

从表2可见，秋水仙碱浓度、处理温度和原球茎培养时间均对鼓槌石斛原球茎多糖含量产生影响，而且各处理因素之间差异显著.

表2 秋水仙碱浓度、温度和培养时间对鼓槌石斛原球茎多糖含量的影响（处理时间：24 h）

原球茎培养时间为20 d时，对照组在处理温度为26 ℃和0 ℃时的多糖含量分别可达16.94%和17.06%，之间差异无显著；秋水仙碱浓度提高为0.1%（处理温度为26 ℃）、0.3%（处理温度为4 ℃）和0.5%（处理温度为8 ℃）时的多糖含量分别为36.62%、20.78%和16.01%；均高于其他温度处理的多糖含量.

原球茎培养时间为40 d时，对照组在处理温度为4℃时的多糖含量为15.92%；秋水仙碱浓度提高为0.1%（处理温度为26 ℃）、0.3%（处理温度为8 ℃）和0.5%（处理温度为8 ℃）时的多糖含量分别为23.12%、18.22%和20.43%；均高于其他温度处理的多糖含量.

原球茎培养时间为60 d时，对照组和秋水仙碱浓度为0.1%和0.3%，处理温度均在在26 ℃时的原球茎多糖含量分别可达15.80%、30.63%、20.77%；秋水仙碱浓度为0.5%，处理温度为8 ℃时的多糖含量为13.81%；均高于其他温度处理的多糖含量.

原球茎培养时间为80 d时，对照组和秋水仙碱浓度为0.1%，处理温度为26 ℃时的多糖含量分别为15.07%、24.45%；秋水仙碱浓度为0.3%和0.5%，处理温度为8 ℃时的多糖含量分别可达21.09%和33.82%；均高于其他温度处理的多糖含量.

分析结果表明，不同浓度秋水仙碱在不同温度条件下处理24 h对提高鼓槌石斛原球茎多糖含量的最佳处理组合为秋水仙碱浓度为0.1%、处理温度为26 ℃、原球茎培养时间为20 d，多糖含量可达36.62%.

2.3 不同条件下处理12 和24 h对鼓槌石斛原球茎多糖含量的影响主体间效应检验

从表3和表4可见，秋水仙碱浓度、处理温度、培养时间等单因素，培养时间 * 处理温度、培养时间 * 秋水仙碱浓度、处理温度 * 秋水仙碱浓度等双因素，以及培养时间 * 处理温度 * 秋水仙碱浓度三因素均对鼓槌石斛原球茎多糖含量产生影响；对应的P值均为0.000，表明上述因素与鼓槌石斛原球茎多糖含量之间具有显著性差异；效应检验的回归系数r均为1.000，表明变量间具有很强的正相关性，影响效应均有统计学意义.

表3 不同浓度秋水仙碱在不同温度下处理12 h对鼓槌石斛原球茎多糖含量影响的主体间效应检验

表4 不同浓度秋水仙碱在不同温度下处理24 h对鼓槌石斛原球茎多糖含量影响的主体间效应检验

3 讨论

鼓槌石斛原球茎经秋水仙碱处理之后，其多糖含量变化差异较大. 研究结果显示，原球茎培养时间为20 d，秋水仙碱浓度为0.1%时，在8 ℃处理12 h的原球茎多糖含量可达35.60%、另在26 ℃处理24 h的原球茎多糖含量可达36.62%，这结果与滕建北等［20］从鼓槌石斛中提取的多糖含量30.65%相吻合，而且均高于相同条件下对照组的多糖含量23.77%和16.94%. 实验结果说明，秋水仙碱和控温处理相结合使用，对鼓槌石斛原球茎多糖积累会产生影响.这一方面可以培育出优质鼓槌石斛种苗提供条件；另一方面可以为以原球茎替代野生或栽培鼓槌石斛来生产鼓槌石斛多糖提供依据. 但高多糖含量的鼓槌石斛原球茎，其染色体数目或植物形态上是否产生变化、组培苗的移栽成活率如何等等方面需进一步深入研究.