碱联合超高压预处理对笋壳酶解效率的影响

王延云，胡强，龚卫华，王燕，吴蔚

（1 乐山师范学院竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室，四川 乐山 614000；2 乐山师范学院生命科学学院，四川 乐山 614000；3 吉首大学杜仲综合利用技术国家地方联合工程实验室，湖南 吉首 416000；4 乐山市产品质量监督检验所，四川 乐山 614000）

笋壳是竹笋加工或成竹后脱落下来的副产品，占竹笋量的50%以上。目前对笋壳的利用主要是作为垃圾丢弃于环境中，或提取其中的二元醇和黄酮类物质等活性物质，但后者的利用率不高，因此对笋壳的综合利用，提高其附加值是目前研究的重点问题。前期的研究表明，笋壳是纤维素、半纤维素等多糖类物质含量丰富的木质纤维资源，来源广且可再生，是理想的生物乙醇制备的原料。但是由于组分中木质素的存在，通过共价键和非共价键与纤维素和半纤维形成紧密的结构，缺乏吸附酶和被微生物降解的能力，使得纤维素难以高效酶解。因此想要高效利用纤维素，对木质纤维原料进行预处理，是解除木质素阻碍和提高酶解效率最关键的一步。

近年来，各种预处理方法得到了发展，包括生物、化学和物理方法，以及这些方法的组合。在生物预处理过程中，褐腐菌、白腐菌和软腐菌等微生物被用来降解木质素和半纤维素，但降解率通常很低且时间较长。化学法主要是采用强酸和强碱预处理木质纤维原料，有效破坏其致密结构，增加酶与底物接触机会，提高糖化效率，但是对设备有一定的腐蚀性。物理方法主要有蒸汽爆破、自水解、微波辅助等，物理手段通常与生物或者化学方法联用，以达到更好破坏木质素纤维素的结构，降低纤维素结晶度的目的。

超高压已经被广泛应用于食品、化工、医药等领域，通过有效破坏微生物的细胞壁和甲基纤维素的结构，达到保鲜和杀菌的目的。近年来，超高压技术被应用于木质纤维素的预处理，研究表明效果良好。Chen等发现超高压预处理甘蔗渣能减小颗粒的尺寸，降低纤维素的结晶指数，增加可及的表面积，从而提高酶解甘蔗渣的效果。Jiang等采用NaOH联合超高压共同预处理竹子，研究发现在100MPa 的条件下，木质素的含量大幅地降低，获得95.1%的理论乙醇得率。在超高压预处理割草、玉米芯、梓锯末和松木屑过程中，发现能显著提高割草和玉米芯酶解还原糖的量，但是对梓锯末和松木屑预处理的效果不明显，这可能和木质纤维素的结构有关。而有些研究发现，单独超高压处理对木质素降解及含量的影响较小，对酶解的效果影响不明显。因此，在本研究中探讨单独超高压、联合碱预处理及不同处理顺序、单独碱预处理四种不同预处理方法对笋壳酶解效率的影响，并首次报道了笋壳作为生物能源应用的材料，系统研究不同预处理条件对样品的化学组成、颗粒大小、晶体结构、表面形貌以及酶解率的影响规律，以期为笋壳的高值化利用提供一个新的方向。

1 实验材料和方法

1.1 原料及试剂

1.1.1 原料

慈竹笋壳采集于四川省乐山市安谷镇。首先将笋壳用蒸馏水洗净，自然阴干，粉碎，过40目筛，60℃过夜烘干，然后采用索式抽提器抽提10h（循环5～6 次/h），提取液为乙醇/水（7∶3，体积比），抽提物60℃过夜烘干后，备用。

1.1.2 试剂

纤维素酶Ctec2，诺维信（中国）生物技术有限公司；木糖，葡萄糖，德国DrEhrenstorfer GmbH公司；氢氧化钠、乙醇、盐酸、硫酸、乙酸及乙酸钠均为分析纯。

1.2 预处理

1.2.1 单独超高压处理（UHP）

准确称取2g慈竹笋壳粉于包装袋（尼龙+聚丙烯耐高温复合材料，下同）中，加入20g/L NaOH溶液，料液比为1∶20，密封并采用超高压处理，设置压强为150～600MPa，温度为室温，时间为10min，超高压处理结束后采用玻璃砂芯坩埚（G4）过滤，并用超纯水多次洗涤至中性，收集固体样品冷冻干燥后，备用。

1.2.2 单独氢氧化钠热处理（AH）

准确称取2g 慈竹笋壳粉于玻璃耐压管中，加入20g/L NaOH溶液，料液比为1∶20，在高压灭菌锅中以121℃条件下水解2h。水解结束后，自然冷却水解液至室温，采用玻璃砂芯坩埚（G4）过滤，并用超纯水多次洗涤至中性，收集固体样品冷冻干燥后，备用。

1.2.3 超高压后氢氧化钠热处理（UHP+AT）

准确称取2g 慈竹笋壳于包装袋中，加入20g/L NaOH 溶液，料液比为1∶20，密封并采用超高压处理，设置压强为150～600MPa，温度为室温，时间为10min，经不同超高压处理后的慈竹笋壳在高压灭菌锅中121℃水解2h，水解结束后，自然冷却水解液至室温，采用玻璃砂芯坩埚（G4）过滤，并用超纯水多次洗涤至中性，收集固体样品冷冻干燥后，备用。

1.2.4 氢氧化钠加热后超高压处理（AT+UHP）

准确称取2g 慈竹笋壳于包装袋中，加入20g/L NaOH 溶液，料液比为1∶20，高压灭菌锅中以121℃条件下水解2h。自然冷却水解液至室温后倒入包装袋中，密封并采用超高压处理，设置压强为150～600MPa，温度为室温，时间为10min。超高压处理结束后采用玻璃砂芯坩埚（G4）过滤，并用超纯水多次洗涤至中性，收集固体样品冷冻干燥后，备用。所有实验平行3组。

1.3 酶水解

称取200mg 经UHP、AH、UHP+AT、AT+UHP预处理样品于10mL离心管中，加入37μL纤维素酶Ctec2（30 酶活单位/mL），用乙酸钠-乙酸缓冲溶液补齐至整个酶解体系总体积为5mL，在酶解液中加入0.02%NaN，以防止细菌感染。将离心管放置在震荡培养箱中，50℃、160r/min、酶解48h。取0.5mL 酶解液，沸水浴10min 以灭活酶活性，取出后冷却至室温，离心（6000r/min，5min），上清液经0.45μm 滤膜过滤，备用。用于测定还原糖的含量。

1.4 组分测定

木质纤维素的组分根据美国可再生能源实验室（NREL）所推荐的方法测定。

1.5 表征方法

1.5.1 扫描电镜（SEM）分析

用碳导电胶带粘取1.2 节预处理后的冻干样品（粉末），置于离子溅射仪（GVC-2000，北京格微科技有限公司）中，对样品表面进行喷金处理，然后采用扫描电镜（S-3000N，日本日立仪器有限公司），加速电压为3.0kV 下，摄取不同放大倍数（10000倍和50000倍）的照片。

1.5.2 结晶度（CrI）分析

采用X射线衍射仪（D8 Advance X，德国布鲁克公司）测定条件为辐射源Cu K；管压40kV，管流40mA；2扫描范围10°～90°，扫描速度6°/min，步长0.02°，样品的结晶指数按照文献[27]计算。

1.5.3 红外光谱（FTIR）分析

采用傅里叶红外光谱仪（Perkin Elmer 2000，美国铂金埃尔默股份公司）KBr压片法，样品均匀分散于KBr 中，质量分数为1%。扫描波数范围4000～400cm，扫描次数设为32次，分辨率4cm。

1.5.4 比表面积和孔结构测定

参考文献[28]方法，采用低温氮气物理吸附仪（ASAP2020，美国麦克仪器有限公司），进样前将样品置于特制密封样品盒中，以5mmHg/s 的抽气速率60℃真空脱气12h。仪器自动进样后，得到样品的N吸附脱附等温线曲线和孔径分布，用BET方程计算比表面积，用-Plot方法测定微孔体积。

1.6 还原糖的测定

采用二硝基水杨酸（DNS）法测定水解液中的还原糖。取样品水解液用蒸馏水稀释10 倍后取0.1mL于10mL比色管中，加入1.4mL DNS试剂并混合均匀，沸水浴5min 后迅速冷却至室温，加入6.5mL 蒸馏水摇匀。取200μL 于酶标板（Spectra-Max190，美国分子仪器公司）中，540nm测定光密度值（OD），以葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线。根据葡萄糖标准曲线计算样品中还原糖的产量。按式(1)计算笋壳中酶水解后的还原糖产率。

2 实验结果与讨论

2.1 预处理对笋壳化学组分的影响

未处理和不同预处理方法对慈竹笋壳化学组分的变化见表1。不同预处理的笋壳与未处理的原料相比，都表现出一定的脱木质素的效果。但是单独超高压脱木质素的效果不明显，在不同压力条件下，脱木质素的效果无明显差异，高静等单独超高压处理水稻秸秆后木质素的脱除率仅为10.9%，说明单独超高压对木质素脱除的影响比较小。而单独AH、AT+UHP 和UHP+AT 三种预处理结果是木质素含量显著减少，纤维素的含量则明显增多。由表1可以看出，超高压联合碱加热其纤维素的含量相较未处理样品都显著增加，而脱木质素效果AT+UHP 处理方式作用更明显，这与后面的酶解效率有一定的相关性。对比分析不同压力条件对木质纤维的影响发现，在压强为600MPa 时，对木质素的脱除效果为最差，这可能是因为压强过大反而影响木质素的溶解。

表1 预处理前后笋壳的化学组分分析

2.2 扫描电镜分析

通过扫描电镜可以观察笋壳预处理前后表面微观形态的变化，压强设置为450MPa。由图1所示，在1000倍和50000倍条件下，未处理和处理的笋壳样品的表面发生了较大的改变。未处理的样品结构紧密，微观表面相对平滑，这种天然的结构是抵抗外界微生物或酶攻击的有力屏障，可以阻止纤维素酶进入笋壳内部，降低酶的可及性。因此直接酶解效率很低，与后面笋壳原料酶水解效率低的结果一致。经过单独超高压处理（450MPa）处理，原料的完整形态被破坏，表面形成不规则的片状，这说明在超高压处理下，笋壳原料被强大的外力作用，在挤压过程中结构受到破坏。单独碱处理和碱联合超高压预处理后，笋壳样品表面变得更松散、杂乱无序，呈现为极度粗糙和高度不规则的形态，结构严重被破坏，结构的改变主要是由大量木质素和部分半纤维素移除，以及预处理过程中纤维呈现不同程度的碎化，纤维之间的结合变得松弛引起的。与徐绍华等采用高温热水预处理后原料结构的改变较为相似，基本都呈现出结构松散，改善后续纤维素酶的可及性，提高酶解效率。

图1 预处理前后笋壳样品的扫描电镜图

2.3 结晶度分析

由图2可以看出，未处理和预处理后的笋壳的X衍射谱图比较相似，每个样品在2=22.4°和18.2°各有一个主要峰和次要峰，与纤维素Ⅰ的特征衍射峰位置一致，说明预处理的样品与未处理样品的微晶结构未发生改变，都是纤维素Ⅰ型晶体结构。但从图2可以发现，不同样品的结晶指数发生了改变。未处理笋壳原料的结晶度指数为53.3%，而单独超高压处理后样品的结晶度指数下降为51.2%，说明超高压对破坏木质纤维素的微晶结构有一定的作用。与高静等采用超高压处理水稻秸秆的结果一致，在单独超高压处理下，水稻秸秆的结晶度指数由54.9%下降到51.2%。而单独碱处理和碱联合超高压处理，笋壳样品的结晶度指数都呈现不同程度升高，主要归因于脱除笋壳中的无定形、非纤维素物质，如半纤维素和木质素。然而Mansikkamäki等发现较高的碱浓度（7%～8%）加强了纤维素在碱溶液中的溶解性，从纤维素Ⅰ变为纤维素Ⅱ，结晶度降低。

图2 预处理前后笋壳样品晶体结构的变化

2.4 红外光谱分析

红外光谱分析用来检测预处理前后竹笋壳结构的变化，由图3所示，预处理后笋壳的特征峰强度有所变化，说明预处理后慈竹笋壳的结构发生了不同程度的改变。1734cm对应的是半纤维素乙酰基的伸缩振动，1600cm和1508cm处的吸收峰对应的是木质素芳环的特征峰，经碱加热处理和碱与超高压联合处理后，与未处理样品相比，该对应的三个峰减弱明显，说明半纤维素和木质素在预处理中发生了降解，与后面成分分析的结果一致，而单独超高压处理峰形改变不明显，说明超高压对半纤维素木质素的降解效果不明显。在纤维素的无定形区，β-1,4-糖苷键中C—O—C 伸缩振动在898cm处的有特征吸收峰，在所有的红外谱图中均有所体现，但谱线AH、UHP+AT、AT+UHP 中此峰的强度加强，说明经过经过单独碱和碱联合超高压处理，样品中的纤维素含量增加，与前面成分分析结果一致。

图3 预处理前后笋壳样品红外光谱图

2.5 比表面积和孔结构分析

由表2可以看出，未处理的样品比表面积及孔体积都较小，其比表面积为0.821m²/g，孔体积为0.003cm³/g，说明慈竹笋壳结构本身致密，纤维素酶很难进入笋壳结构内部和纤维素形成有效的接触，酶解效率低。另外，无论采用哪种预处理方法，预处理后样品的比表面积及孔体积都变大，说明经过预处理后样品的基质结构都被不同程度地破坏，引起比表面积以孔体积增加，纤维素酶和纤维素接触反应机会增多，酶解效率增加。与未处理样品相比，单独NaOH热处理后样品的表面积和孔体积增大，比表面积为1.385m²/g，孔体积为0.006cm³/g，表明NaOH 预处理可以脱除部分的半纤维素，半纤维素的移除导致的样品结构松动，样品表面出现多孔且有碎片剥离出来（可从图1中得到证实），酶进入内部的通道增多，比表面积和孔体积增加，酶解效率增加。UHP 预处理后，样品的表面积和孔体积有所增大，分别为0.892m²/g 和0.004cm³/g，样品表面孔数量增多、表面形貌变得不规则（图1）。UHP+AT和AT+UHP预处理后，样品比表面积和孔体积增加得更多，在AT+UHP条件下达到最大，比表面积为2.590m²/g，孔体积为0.010cm³/g，原因是木质素和部分半纤维素的脱出，木质素是细胞壁支撑结构，木质素的移除可以导致细胞壁坍塌，再加上部分半纤维素的移除，样品表面孔数量增多、表面形貌变得不规则（图1），因此经预处理后样品的比表面积和孔体积增大。但AT+UHPE 预处理后，更多的纤维素暴露出来（图1），酶解效率最高。

表2 预处理前后笋壳样品比表面积和孔体积

2.6 酶水解效率

综上所述，碱联合超高压预处理是一种对木质纤维素生物质的有效预处理方法。木质素含量、结晶度、比表面积、粒径等影响酶解效率。表3 对比分析了未处理、单独碱处理、单独超高压预处理、AT+UHP 和UHP+AT 预处理4 种方法对笋壳纤维素的酶解效率，并进一步对比分析了不同压力条件对酶解效率的影响。在纤维素酶水解48h后，未处理样品的酶解效率仅为13.51%，单独碱处理和单独超高压预处理的样品酶解效率均有所提高，分别为75.35%和49.13%～53.74%。单独碱处理笋壳的酶解效率与Jiang 等单独碱处理竹笋和两年生竹样品的结果相似，因为碱处理在一定程度上会降低木质素的含量，破坏笋壳原料的完整性，使结构松散、多孔，从而提高酶解效率。而单独超高压处理对木质素降解的效率比较低，与Yang 等的研究结果一致，但是超高压会破坏木质纤维原料的完整结构，使其表面呈现出不规则碎片，降低纤维素的结晶性，都能在一定程度上增加纤维素酶对底物的可及性。

由表3 可以看出，无论是AT+UHP 还是UHP+AT预处理，都能很大程度上提高样品的酶解效率，明显高于单独碱处理和单独超高压处理。AT+UHP在450MPa的条件下酶解效率高达97.89%，与Jiang等等联合处理竹笋和两年生竹子的酶解效率相似。而UHP+AT 预处理在450MPa 的条件下酶解效率为96.94%，说明碱和超高压处理先后顺序对酶解效率的影响不明显。也进一步说明碱和超高压联合预处理是一种高效的预处理方法，显著提高样品的酶解效率。

不同压力对酶解效率的影响可由表3看出，随着压强的增加，不同预处理样品的酶解效率在不断提高。但是当压强超过450MPa 以后，进一步增加压强反而会让样品的酶解效率呈现稍微下降，原因可能是当压强达到450MPa 以后，木质纤维素结构的改变已经达到极限，随后外界压强的增加反而会稍微覆盖前面已经形成的多孔结构，从而导致酶解效率有一定程度的下降。

表3 未处理和预处理后笋壳样品酶解效率

3 结论

采用UHP、AH、UHP+AT 和AT+UHP 四种方法预处理后的样品，与未处理的笋壳原料相比，酶解效率均有大幅度提高。采用UHP （150MPa、300MPa、450MPa 和600MPa）预处理样品时，压力的变化会影响样品的酶解效率；UHP 预处理样品的酶解效率（49.13%～53.74%）均低于AH 预处理样品的酶解效率（75.35%）。UHP（450MPa）+AT 和AT+UHP（450MPa）预处理样品，在50℃酶解48h 的条件下，其酶解效率分别可达96.94%和97.89%，说明碱加热和超高压处理顺序对酶解效率影响不明显，但碱联合超高压处理能显著提高酶解效率，主要是因为在预处理过程中降低了样品中的木质素和半纤维的含量，碎化纤维之间的连接，破坏样品表面的微观结构，使其结构松散、粗糙和多孔，提高纤维酶和底物的可及率，从而提高酶解效率。另外，碱联合超高压预处理样品时，洗脱滤液可进一步通过调节pH、浓缩、沉淀等步骤，分离、利用碱溶性半纤维素、木质素和回收碱液。通过本研究，期望碱联合超高压预处理可以成为一种潜在的生物质预处理方法。