可编程的环形LED阵列光源在显微成像中的应用

2022-04-11马骁邬志锋

广东交通职业技术学院学报 2022年1期

马骁，邬志锋

（广东交通职业技术学院，广东广州 510650）

光学显微镜是生物学、医学等领域中必不可少的重要工具之一。[1-5]它由照明装置、载物台、成像透镜组和目镜等组成。早期研究主要关注成像透镜组的成像性能，随着对光学显微成像原理的深入研究，人们开始认识到照明技术在显微成像中具有重要作用。传统光学显微镜普遍采用柯勒照明方式，[1-5]照明光一般由卤素灯等热光光源提供，通过加热灯丝发光。热光光源的优点是光谱宽，缺点是光能转化率低，使用寿命短，长时间工作需要散热装置。此外，热光光源灯丝需要制成特定的弯曲形状，以增大发光面积，保证照明亮度。不能直接提供均匀的照明，需要使用复杂的光路，才能实现均匀的照明。

发光二极管（light emitting diode，LED）正逐渐取代传统照明光源，成为现代显微成像的标准照明器件。LED 是一种单色性好，发光亮度高，没有散斑噪声的新式照明光源。LED光源可以直接提供均匀且高亮的照明，无需增加复杂的照明光路。LED芯片发光区域具有一定面积，可以看作是一个很小的面光源，且LED具有聚光镜结构，发光区域每一点发出的光线经聚光镜，可形成一定发散角的光束，当样品与LED光源之间距离远大于样品的尺寸时，照射在样品上的光束可近似看作平行光。此外，单颗LED 体积较小，便于排列成各种阵列形式，可实现多入射角及多方位角的斜照明，这是柯勒照明难以做到的，更重要的是LED光源可使用最简单的电路实现编程控制，为实现计算显微成像提供了重要的工具。例如，采用方形排布的LED阵列光源，实现了数字重聚焦显微成像[6-7]、光场显微成像[8]、相位显微成像[9-11]、傅里叶叠层显微术等，[12-16]具有很高的应用价值。

由于显微镜成像系统透镜为圆形，成像视野是圆形区域，圆环形排布的阵列LED光源，照明利用率更高、更实用。本文设计并介绍了一种环形阵列LED光源，并举例给出了该光源在显微成像方面的应用。

2 光源设计

常见的LED有直插式和贴片式两种比较常见的封装结构，如图1所示。

图1a 是直插式LED 封装结构示意图。直插式LED是将元件高度集成封装，属于结构一体化设计。其结构中有反光帽、透镜等聚光结构，且直插式LED芯片发光区较小，聚光结构有很好的汇聚光线作用。因此，一般情况下，直插式LED发射角小，光线集中，照明距离远，但照射范围较小。这里以一种高亮度直插式LED （504 LGC）为例，图1b 给出了这种直插式LED 的辐射角度与辐射强度关系图，其中0 方向为LED发光中心方向，可以看到，发光集中在与发光方向夹角小于30 的区域内，那么这种LED 的发射角（50%辐射强度时的角度）约为15 。

图1 两种常见的LED封装结构及辐射角度示意图

而贴片式LED，如图1c 所示，LED 芯片固定在大面积金属底座上，散热能力强，且可将控制芯片集成在灯体内，更容易实现编程控制。但可以看出，贴片式LED芯片，也就是发光区域更大，只有一个透镜结构汇集光线，发射角较大，照明范围大，照明距离近。图1d给出了一种三色贴片式LED （3528 RGB）辐射角与辐射强度的关系，可以看到，发出的光集中在与发光中心夹角小于60 的区域内，这种LED发射角约为60 。

为了便于对比两种不同封装的LED各自的特点，列出表格如表1所示。

表1 直插式LED和贴片式LED的特点对比

作为显微照明光源，首先必须满足高亮且照明均匀两个条件。由于显微样品通常较小，无论是哪种LED光源，只要距离样品足够远，就可以在照明中心范围内，为样品提供均匀照明光。然而，对于贴片式LED，由于发射角过大，光线发散，将会造成照明光的浪费。相比之下，直插式LED发射角小，功率相同时体积小，因此，更便于排成阵列式可控光源。

由于越高倍数的显微物镜，需要的照明光越强。为了验证直插式LED 可以提供足够高的亮度且均匀的照明，这里设计了一款LED 可以配合100 倍、数值孔径NA = 1.25 的显微物镜使用，设计的环形LED 阵列结构示意图如图2a 和图2b 所示，制作完成的实物环形LED 阵列光源如图2c 所示。

图2 LED光源结构示意图

环形LED 阵列光源外径为176 mm，内径为140 mm，厚度15 mm，由60颗相同LED子光源等间隔均匀排列在环形内面构成，总发光功率24W，外壳采用的是铝合金材质，便于散热。每个LED子光源的中心波长为520 nm，发光带宽为10 nm，单颗LED子光源发光功率0.4 W，发射角约17.5 。每个LED 发光指向样品，LED 距离样品34mm，计算出LED 发光中心光束与灯环平面夹角，也就是入射角约为64 ，照明数值孔径约为0.9。刚好与柯勒照明可提供的最大照明数值孔径相等。

由于需要对环形LED 阵列光源进行编程控制，我们设计制作了光源控制电路板，如图3所示。

图3 环形LED阵列光源控制电路板

光源控制电路由控制模块和电源管理模块构成的。控制模块分为主控部分和辅助控制部分，主控部分由32 位单片机（STM32F103）和移位寄存器组成。移位寄存器用于扩展IO 口数目。辅助控制部分由USB 总线转接芯片（CH340G）等元件组成。电源管理模块提供稳压直流供电。使用前通过ST-link，将LED 环形斜照明光源控制程序烧录至单片机。使用时，通过USB串口向单片机发送指令，实现对多个LED子光源的独立控制，进而可以实现不同组合的照明方式。

3 环形LED阵列光源显微成像实验

图4 所示是使用设计好的环形LED 阵列光源，在标准透射式的明场显微镜（Nikon 80-i）光路上搭建的成像系统。搭建过程十分简单，只要将光源中心对准光轴，光源水平固定在载物台下方，光源LED 所在平面距离样品34 mm 即可。使用的物镜是100倍、NA = 1.25的尼康平场消色差油镜，CMOS 相机（Andor，Zyla 4.2P）像素大小为6.5 μm。由于环形LED阵列光源可提高明场显微横向和轴向分辨率，可以对样品进行光切片成像，这里使用一个Z 轴纳米位移台在Z 轴方向上进行切片成像。对比实验中柯勒照明设置照明数值孔径也为0.9。

图4 环形LED阵列照明显微成像装置

采用上述结构可以实现多种显微成像，例如图5 是硅藻的斜照明成像结果，这种成像是使用单颗LED在一个照明方位角实现的，图中照明方位从上至下，可以清晰看到硅藻内部结构。斜照明成像[17]适合本身透明且未染色的样品成像，得到的是相位梯度像，[11,18]可显示出透明样品的结构细节，而柯勒照明一般不用于未染色透明样品成像，对比度低且噪声大。

图5 硅藻的斜照明图像

60 个LED 全部点亮可以实现光切片成像。[19-20]图6 是银纳米线的光切片图像，图6 a～c 是柯勒照明下图像，相邻图像间Z 轴方向相差360 nm。图6 d～f 是环形LED阵列照明下的图像，相邻图像间Z 轴方向相差360nm。可以看到，在环形LED阵列照明下，银纳米线从离焦到聚焦，再从聚焦到离焦的现象十分明显，说明所设计的光源，可以提高显微成像的轴向分辨率。且环形LED阵列光源照明下显微图像比柯勒照明显微图像中银纳米线明显更细，说明分辨率更高。