加味小陷胸汤对接种人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生长及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

程 楠，王 靓，2，施 慧，丁 芮，洪星辉，方海雁，王恩宇，黄金玲2，

(1.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；2.复方中药安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；3.安徽中医药大学护理学院，安徽 合肥 230012；4.中国科学技术大学附属医院，安徽 合肥 230001)

胃癌是消化道常见恶性肿瘤，其发病率及死亡率均高居恶性肿瘤前列[1]。增殖与侵袭转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，是临床上绝大多数肿瘤包括胃癌患者治疗失败、复发和死亡的首要原因[2]。因此，防治恶性肿瘤侵袭转移是改善胃癌患者预后的关键所在。加味小陷胸汤系《伤寒论》中“小陷胸汤合四君子汤”化裁而成，具有清热解毒、化痰破瘀、补气运脾之功。课题组前期进行了小鼠肉瘤S180细胞株在体移植瘤模型及人胃癌SGC-7901细胞株体外侵袭转移的实验研究，结果表明该方具有抑制肿瘤侵袭转移的作用[3-5]。本研究以裸鼠为研究对象，通过人胃癌SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型，探讨加味小陷胸汤抗胃癌的生长增殖及侵袭转移的效应和机制，以期为其临床合理应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性BALB/c-nu裸小鼠50只，6～8周龄，体质量为18～22 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001]。采用无菌颗粒饲料；净化水自由饮水；光照：8:00—20:00；温度：22 ℃；通风：每小时30～100次；湿度：40%～70%；噪音：小于60 dB。适应性饲养1周后用于实验。本实验由安徽中医药大学实验动物伦理审查委员会审核通过，批号 AHUCM-mouse-2020035。

1.2 细胞株 人胃癌细胞SGC-7901细胞系，购自中国医学科学院肿瘤研究所。

1.3 药物 加味小陷胸汤由黄连、半夏、瓜蒌、白花蛇舌草、薏苡仁、茯苓、壁虎等组成，饮片均购自安徽济仁药业有限公司，由安徽中医药大学第一附属医院药剂科采取水提醇沉工艺(10倍量水，提取3次，每次提取45 min)制成干浸膏(每克含3.58 g生药)；卡培他滨片(批号 15081356)由江苏恒瑞医药股份有限公司生产。

1.4 主要试剂 DMEM培养液(批号 8119064)：美国Gibco公司；胎牛血清(批号 20160930)：杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3β)、原癌基因蛋白(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体、β-actin抗体(批号 ATUMR2101、ATUMR2101、K0602G、K0207G、ab8226)：美国Abcam公司；IgG/HRP标记物：北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.5 主要仪器 细胞培养箱(型号Forma 370)：美国Thermo公司；荧光定量RT-qPCR仪(型号7900)：美国ABI公司；全电动型高级倒置荧光显微镜(型号TH4-200)：日本Olympus公司；低温离心机(型号3K15)：美国Sigma公司；电泳仪(型号FCM)：美国Protein Simple公司；ATOM全自动酶联免疫工作站：意大利MAROCHE公司。

2 方法

2.1 模型复制 将人胃癌细胞SGC-7901细胞接种于裸鼠右侧腋部皮下注射0.1 mL；待裸鼠接种处皮下移植瘤包块达到直径10 mm左右时，处死裸鼠，完整剥离瘤组织，将瘤组织分割成1.0 mm3左右小块，用套管针接种于正常裸鼠右侧腋部皮下进行传代，将传至第四代模型裸鼠瘤组织1.0 mm3左右小块，用套管针接种于每只裸鼠右前肢腋下，10 d后腋下可触及明显肿块，隆起于皮肤表面者则视为裸鼠皮下人胃癌移植瘤模型复制成功。

2.2 分组及处理 将移植瘤模型裸鼠随机分为5组：模型组，加味小陷胸汤低剂量(20.67 g/kg，相当于成人临床等效剂量的1倍)、中剂量(41.34 g/kg)、高剂量(82.68 g/kg)组，卡培他滨组(0.40 g/kg)，每组10只。灌胃给药，灌胃容积20 mL/kg，模型组灌胃等容积蒸馏水，于模型复制第10天开始，每天1次，连续给药4周；卡培他滨组给药5 d、停药2 d为1个疗程，连续给药4个疗程。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 裸鼠一般情况观察 动态观察各组裸鼠生长状态、体质量变化。

2.3.2 观察不同时间节点裸鼠移植瘤体积 于模型复制第10天各组按剂量给药，给药后每7 d用游标卡尺测量移植瘤的长径及垂直短径，按公式计算移植瘤体积，体积=(长径×短径2)/2。

2.3.3 裸鼠移植瘤生长抑制率 于末次药后30 min，颈椎脱臼法处死裸鼠，完整剥离瘤体，称瘤体质量，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=(模型组肿瘤质量-药物组肿瘤质量)/模型组肿瘤质量×100%。

2.3.4 Western blot法检测肿瘤组织β-catenin、GSK-3β、C-Myc和VEGF蛋白表达水平 取肿瘤组织50 mg，匀浆后细胞裂解，提取组织蛋白，经电泳、转膜、封闭、一抗孵育过夜，二抗室温孵育，ECL化学发光显影，Gelpro32蛋白印迹分析软件检测蛋白表达情况。

2.3.5 RT-PCR法检测肿瘤组织β-catenin、GSK-3β mRNA表达水平 β-catenin上游引物：5′-GCACGTCCCCTTGGTTAGAA-3′；下游引物：5′-CAGGCAAACAGGTGCTCAAC-3′。GSK3β上游引物：5′-GGACTAAGGTCTTCCGACCC-3′；下游引物：5′-TAGCATCTGACGCTGCTGTG-3′。β-actin上游引物：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCT法进行分析。

2.3.6 ELISA法检测移植瘤组织基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9水平 提取移植瘤组织匀浆，按照试剂盒说明书，在450 nm波长下测定吸光度，检测MMP-2、MMP-9含量。

3 结果

3.1 一般情况观察 接种瘤体10 d后，裸鼠腋下可触及明显肿块，运动敏捷，反应灵活，随着瘤体逐渐增大，模型组裸鼠出现蜷缩不动、反应迟缓、皮色枯竭等表现，37 d死亡1只。药物干预过程中，卡培他滨组干预4个疗程，裸鼠精神萎靡，皮色枯竭，30 d和33 d分别死亡1只；加味小陷胸汤各剂量组给药4周裸鼠精神萎靡，活动减少，但未见死亡。加味小陷胸汤各剂量组裸鼠接种移植瘤第10、17、24、31、38天各时间点与模型组比较，裸鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)；卡培他滨组自第17天起体质量呈递减趋势，第31、38天与模型组及加味小陷胸汤各剂量组比较，裸鼠体质量显著减少(P<0.05)。结果说明加味小陷胸汤对SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠的生存和体质量无明显影响。见表1。

表1 加味小陷胸汤对移植瘤模型裸鼠体质量的影响

3.2 加味小陷胸汤对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤增殖的影响

3.2.1 加味小陷胸汤对裸鼠移植瘤体积的影响 移植瘤接种后第10天，各组裸鼠右侧腋下均可触及明显包块，包块体积随时间呈递增趋势，且第17天至第38天卡培他滨组和加味小陷胸汤各剂量组裸鼠腋下包块体积均小于同时间点模型组。第24、31、38天，与模型组比较，卡培他滨组和加味小陷胸汤各剂量组包块体积显著减少(P<0.05)；而与卡培他滨组比较，加味小陷胸汤各剂量组包块体积较大，第38天加味小陷胸汤各剂量组与卡培他滨组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明加味小陷胸汤和卡培他滨可有效抑制SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠肿瘤的生长。见表2。

表2 加味小陷胸汤对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤体积的影响

3.2.2 加味小陷胸汤对裸鼠移植瘤质量的影响 与模型组比较，加味小陷胸汤各剂量组、卡培他滨组可显著降低移植瘤质量(P<0.05)；与卡培他滨组比较，加味小陷胸汤低、中剂量组移植瘤质量显著增加(P<0.05)。随着加味小陷胸汤剂量的增加，对裸鼠移植瘤的抑制率增加；高剂量组抑制率与卡培他滨组相似。结果说明加味小陷胸汤和卡培他滨可显著抑制SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠肿瘤的生长。见表3。

表3 加味小陷胸汤对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤质量的影响

3.3 加味小陷胸汤对裸鼠移植瘤组织β-catenin、GSK-3β、C-Myc和VEGF蛋白表达水平的影响 连续用药4周后，加味小陷胸汤各剂量组裸鼠移植瘤组织中β-catenin、C-Myc和VEGF蛋白表达水平均明显降低，GSK-3β蛋白表达水平明显升高，与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明加味小陷胸汤可以显著调节移植瘤组织Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、C-Myc和GSK-3β及下游VEGF蛋白的表达水平。见图1。

图1 各组裸鼠移植瘤组织中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和VEGF蛋白表达水平比较

3.4 加味小陷胸汤对裸鼠移植瘤组织β-catenin、GSK-3β mRNA表达水平的影响 连续干预4周后，加味小陷胸汤各剂量组移植瘤组织中β-catenin mRNA表达水平明显下降，GSK-3β mRNA表达水平则明显升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明加味小陷胸汤能够显著调节移植瘤组织Wnt/β-catenin信号通路GSK-3β和β-catenin mRNA表达水平。见表4。

表4 各组裸鼠移植瘤组织中GSK-3β、β-catenin mRNA表达水平比较

3.5 加味小陷胸汤对裸鼠移植瘤组织中MMP-2、MMP-9水平的影响 连续用药4周后，加味小陷胸汤各剂量组瘤组织中MMP-2、MMP-9水平明显降低，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明加味小陷胸汤能够显著抑制移植瘤组织中MMP-2、MMP-9表达。见表5。

表5 各组裸鼠肿瘤组织中MMP-2、MMP-9水平比较

4 讨论

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，局部复发和侵袭转移是胃癌的主要死亡原因。研究[6]表明，Wnt/β-catenin信号通路可能参与调节胃癌的病理进程，干预胃癌的侵袭转移，是胃癌的潜在治疗靶点。Wnt/β-catenin是经典Wnt信号通路[7-9]，β-catenin是该通路较为关键和核心的信号转导因子，未被激活时，胞质中β-catenin被轴抑制蛋白(Axis inhibition protein,AXIN)、结肠腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyosis coli,APC)、GSK-3β等蛋白组成的降解复合体磷酸化，进而被泛素化并降解[10-12]；当通路激活时，抑制APC/AXIN/GSK-3β降解复合体的稳定性与活性，抑制β-catenin蛋白降解，转移入核，结合T细胞因子/淋巴增强因子转录因子，激活c-Myc、AXIN2、Cyclin D1等靶基因转录，进而参与细胞增殖、分化、运动等功能的调节[13-16]。胃癌病理过程中，Wnt/β-catenin信号通路激活可刺激MMP2、MMP9、VEGF等表达，调节胃癌血管新生及上皮间质转化等环节，促进肿瘤的生长、侵袭和转移[17-18]。

中医认为胃癌病在胃脘[19]，因癌毒在体内蕴蓄积聚而发，癌毒痰瘀胶结盘踞，是胃癌的关键病理所在。癌毒肆虐，耗伤气血，伤人正气，邪实导致正虚而虚实夹杂，因此胃癌治疗当以解毒祛邪为要，兼顾扶正补虚，清热解毒、化痰祛瘀是基本治疗大法。加味小陷胸汤是由小陷胸汤合四君子汤化裁而成，该方可改善中晚期胃癌患者生活质量，有效抑制胃癌的复发转移。

本研究结果表明，加味小陷胸汤可有效抑制SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠肿瘤的生长，中、高剂量组较低剂量组更为有效，高剂量组药效与卡培他滨组更为接近；可显著调节Wnt/β-catenin信号通路及下游信号分子的蛋白及基因表达水平，且对裸鼠无明显的毒性反应。实验证实加味小陷胸汤调节Wnt/β-catenin信号通路的作用，并初步揭示该作用与干预胃癌生长及侵袭转移有关。下一步课题组将通过体外细胞干预，进一步明确其调控靶点，为其临床应用提供依据。